劉香梅，趙維波，袁 文，王 靜，吳玉娥，張 鈺

(廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所,廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510663)

小鼠肝炎病毒，冠狀病毒科，冠狀病毒屬，基因由單股RNA構(gòu)成。主要經(jīng)呼吸道消化道感染，小鼠感染后，多呈隱性感染，但在實(shí)驗(yàn)等應(yīng)激因素下，可導(dǎo)致免疫抑制或免疫刺激，抑制淋巴球增殖反應(yīng)，以及小腸淋巴組織Peyer’S Patch中B細(xì)胞免疫球蛋白的分泌，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成嚴(yán)重干擾。且該病毒在我國(guó)廣泛流行，血清流行病學(xué)調(diào)查1982年, 我國(guó)普通小鼠群中小鼠肝炎病毒的感染率為20%～100%[1]，1997年～1999年，北京地區(qū)普通級(jí)小鼠肝炎病毒感染率為59%～87%[2]，2003年～2007年，廣東省6個(gè)屏障實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)設(shè)施，5個(gè)設(shè)施曾先后出現(xiàn)小鼠肝炎病毒感染的情況[3]。小鼠肝炎病毒，是影響我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量最常見(jiàn)的微生物項(xiàng)目，也是各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)單位和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用單位重點(diǎn)關(guān)注的項(xiàng)目。

近2年來(lái)，隨著實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理者對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量重要性認(rèn)識(shí)的逐漸提高，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康監(jiān)測(cè)和哨兵鼠的設(shè)置越來(lái)越受到重視，但有關(guān)哨兵鼠如何設(shè)置，何時(shí)取樣，取什么樣檢測(cè)陽(yáng)性率更高的問(wèn)題，我們?nèi)鄙僦苯拥臄?shù)據(jù)支持。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇50只ICR小鼠，通過(guò)更換“臟墊料”的方式在MHV污染的設(shè)施內(nèi)設(shè)置哨兵鼠，并對(duì)抗原抗體存在情況進(jìn)行跟蹤。為哨兵鼠的檢測(cè)取樣提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ICR小鼠，雌性，50只，6～8周齡，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK(湘)2011-0003】。本實(shí)驗(yàn)在廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所負(fù)壓感染實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行【SYXK(粵)2012-0122】。

1.2 “臟墊料”

“臟墊料”即污染源，經(jīng)攜帶MHV病毒的小鼠用過(guò)的滅菌木屑?jí)|料混合而成。

1.3 儀器和試劑

酶標(biāo)儀 BIO-RAD680，實(shí)時(shí)熒光PCR儀 ABI7300。

小鼠肝炎病毒(MHV)抗體檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自SMART公司。批號(hào)：SM908。

1.4 樣品的收集

將ICR小鼠以開(kāi)放籠盒方式飼養(yǎng)在MHV污染的負(fù)壓屏障實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)，每籠飼養(yǎng)5只，放置于籠架的底層位置，每周1次固定時(shí)間更換墊料。更換的墊料為設(shè)施內(nèi)MHV攜帶鼠用過(guò)的混合“臟墊料”。分別在實(shí)驗(yàn)第2，4，8，14，21，28，35，42，56和84天各剖殺動(dòng)物5只，采集血液、盲腸內(nèi)容物、糞便、肝臟以及肺臟檢測(cè)抗原抗體分布情況。

1.5 血清抗體測(cè)定

應(yīng)用SMART公司的小鼠肝炎抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 病毒測(cè)定

熒光定量PCR.具體可參見(jiàn)文獻(xiàn)[4]。

2 結(jié)果

2.1 血清抗體陽(yáng)性檢出率

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始第2天和第4天顯示抗體陽(yáng)性檢出率為0，第8天開(kāi)始，抗體檢出陽(yáng)性，陽(yáng)性率為100%(5/5)，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束抗體陽(yáng)性率仍為100(5/5)(表1)。

表1 小鼠肝炎病毒抗體陽(yáng)性率

2.2 各檢測(cè)樣本抗原陽(yáng)性檢出率

熒光定量PCR方法檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示，實(shí)驗(yàn)的第2天，肺臟中開(kāi)始檢測(cè)到小鼠肝炎病毒，檢出率為20%(1/5)，其他臟器中未檢出小鼠肝炎病毒；第4天，肺臟、盲腸、糞便和肝臟均檢出小鼠肝炎病毒，其中肝臟檢出率為60%(3/5)，其他臟器均為100%(5/5)，檢出率明顯升高；第8天，肺臟、盲腸、糞便和肝臟仍均檢出小鼠肝炎病毒(檢出率均為100%)；從第14天開(kāi)始，病毒檢出率開(kāi)始下降，同一時(shí)間點(diǎn)比較，盲腸內(nèi)容物檢出率最高，其次是糞便的檢出率；84 d后，所有的組織和樣本均不能檢測(cè)到病毒的存在(表2)。

2.3 抗原與抗體間的關(guān)聯(lián)分析

小鼠感染后不同時(shí)間點(diǎn)的抗體水平和主要臟器病毒載量(Ct值)動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)圖見(jiàn)圖1。臟器載毒量在第2天肺部首次檢出，第4天達(dá)到最高水平，之后逐步減少，84 d后主要臟器組織中檢測(cè)不到病毒。抗體產(chǎn)生時(shí)間晚于病毒檢出時(shí)間，在第8天開(kāi)始檢測(cè)到較高水平抗體，并持續(xù)到試驗(yàn)結(jié)束，與預(yù)期基本一致，符合抗原抗體產(chǎn)生規(guī)律。但抗原持續(xù)時(shí)間稍微延長(zhǎng)。

表2 小鼠肝炎病毒陽(yáng)性檢出率情況

3 討論

近年來(lái)，隨著基因工程小鼠應(yīng)用的急劇增長(zhǎng)以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理者對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量重要性認(rèn)識(shí)的提高，哨兵小鼠的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，但關(guān)于哨兵鼠如何設(shè)置，如何送檢，才能到達(dá)較高的檢出率缺乏相關(guān)的數(shù)據(jù)支持，針對(duì)這些問(wèn)題，本研究分析獲得了ICR小鼠自然感染小鼠肝炎病毒后抗原抗體的持續(xù)性以及分布性等相關(guān)數(shù)據(jù)。

血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始第8天，動(dòng)物開(kāi)始檢測(cè)到較高水平的抗體(陽(yáng)性率為100%)，并持續(xù)到試驗(yàn)結(jié)束(84 d)未見(jiàn)顯著降低，與人工感染小鼠肝炎病毒后抗體反應(yīng)特征一致[5-7]，表明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染小鼠肝炎病毒后，抗體產(chǎn)生時(shí)間周期短，并將會(huì)維持較長(zhǎng)的時(shí)間。

主要組織樣本抗原檢測(cè)結(jié)果顯示，在接觸病原2 d內(nèi)，實(shí)驗(yàn)小鼠在肺臟中檢測(cè)到了病毒存在，這一結(jié)果與病原的感染途徑吻合，呼吸系統(tǒng)最早接觸潛到病原，從而最早檢測(cè)到病原存在，隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，多組織樣本中均檢測(cè)到病毒存在，并且以盲腸內(nèi)容物最高，其次是糞便，表明消化系統(tǒng)是該小鼠肝炎病毒毒株的主要侵襲目標(biāo)，同時(shí)也證實(shí)了小鼠肝炎病毒感染途徑的多樣性。就病毒的檢出時(shí)間和檢出率來(lái)看，自然感染小鼠排毒時(shí)間較人工感染小鼠肝炎病毒明顯延長(zhǎng)[5-8]；但與Ferdinand等[9]所描述的小鼠肝炎病毒排毒時(shí)間基本相符。分析原因可能與毒株的類(lèi)型及其毒力強(qiáng)弱有關(guān)，也有可能由感染方式所造成。

血清抗體與抗原檢測(cè)結(jié)果的關(guān)聯(lián)性分析顯示，實(shí)驗(yàn)第2天，抗原檢出陽(yáng)性，第8天，抗體出現(xiàn)較高水平，這說(shuō)明第2天病毒就經(jīng)呼吸道感染了小鼠，并刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)，抗體產(chǎn)生，并于第8天檢出，但是抗原的存在周期較短，隨著抗體的產(chǎn)生，動(dòng)物體內(nèi)的病毒逐漸被清除，因此抗原只能作為早期檢測(cè)的輔助手段。而抗體檢測(cè)則具有較高的穩(wěn)定性。

綜上所述，小鼠肝炎病毒的日常監(jiān)測(cè)樣本可以通過(guò)更換“臟墊料”的方式設(shè)置哨兵動(dòng)物。哨兵動(dòng)物的檢測(cè)早期可以進(jìn)行抗原檢測(cè)；但2周后則只能選擇血清學(xué)方法確認(rèn)動(dòng)物是否感染。

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