胡文娟，梁 磊，尤金煒，方 天，劉 彪，陳 莉，賈春梅，許龍祥，惲?xí)r鋒

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科，全軍實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科普與倫理教育基地，全國(guó)科普教育基地， 南京 210002)

動(dòng)物模型是人類(lèi)腫瘤學(xué)研究的重要工具之一，人類(lèi)腫瘤裸鼠移植模型已成為腫瘤學(xué)研究的重要方法。在人類(lèi)腫瘤移植于裸鼠受體前，遠(yuǎn)期排斥作用和受體動(dòng)物容易死亡是人類(lèi)腫瘤異種移植成功率低的主要原因[1]。而且其還有操作復(fù)雜、觀察困難等缺點(diǎn)。如今，裸鼠已能夠廣泛應(yīng)用于腫瘤模型的建立與研究。

GFP裸鼠是本科室將綠色熒光蛋白基因(green fluorescence protein，GFP)導(dǎo)入BALB/c nude小鼠而得來(lái)。GFP現(xiàn)已成為細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)中應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記之一。GFP裸鼠因自身含有標(biāo)記蛋白與普通裸鼠相比而具有明顯的優(yōu)勢(shì)，國(guó)內(nèi)外目前關(guān)于普通裸鼠腫瘤模型的建立已有不少，但還未曾有使用GFP裸鼠建立腫瘤模型的例子。因此，將GFP裸鼠與普通裸鼠在腫瘤模型的建立方面做比較研究具有較大的科學(xué)意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備

分別取雌性SPF級(jí)裸鼠及GFP裸鼠(GFP nude)各10只，約為5～6周齡,體重15～20 g(裸鼠購(gòu)于常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK(蘇)2011-0003】，GFP裸鼠為本科室提供【SCXK(軍)2012-0014】)，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均置于無(wú)菌條件下飼養(yǎng)【SYXK(軍)2012-0047】，飼料和水自由攝入，嚴(yán)格滅菌處理，保持一定的溫度與濕度。

1.2 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)及收集

將人類(lèi)結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞株KM12SM采用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，內(nèi)含青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/mL，置37℃、5%CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，離心3 min，棄上清液，經(jīng)無(wú)血清的培養(yǎng)基液洗3遍次，細(xì)胞計(jì)數(shù)，加無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL。

1.3 動(dòng)物模型構(gòu)建

使用1 mL無(wú)菌注射器將細(xì)胞懸液分別注入GFP裸鼠及普通裸鼠右側(cè)腋窩皮下，每只實(shí)驗(yàn)鼠的注射量為0.2 mL，約含細(xì)胞量2×106個(gè)。

1.4 成瘤情況觀察

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，觀察兩組實(shí)驗(yàn)鼠的一般情況(飲食、飲水、睡眠、排泄、活動(dòng)狀態(tài)等)，成瘤時(shí)間(以肉眼可見(jiàn)瘤結(jié)節(jié)為標(biāo)準(zhǔn))，每3 d測(cè)量并記錄實(shí)驗(yàn)鼠的體重，測(cè)量瘤體長(zhǎng)徑、短徑等，計(jì)算腫瘤體積(腫瘤體積=長(zhǎng)徑×短徑2/2)，直至移植瘤全部壞死，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。

1.5 病理檢查

處死實(shí)驗(yàn)鼠，剝?nèi)∧[瘤組織及周?chē)馨徒Y(jié)，置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，顯微鏡下觀察腫瘤組織生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

GFP裸鼠與裸鼠均未見(jiàn)死亡，成瘤率100%。實(shí)驗(yàn)初期兩組實(shí)驗(yàn)鼠精神狀態(tài)較好，飲水、飲食正常，反應(yīng)敏捷；隨著后期瘤體的增大，均出現(xiàn)進(jìn)食，活動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍等現(xiàn)象，裸鼠體重下降較為明顯。

2.2 腫瘤出現(xiàn)時(shí)間

GFP裸鼠組于接種后4～5 d在右前肢腋窩皮下長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的腫瘤，裸鼠組于接種后6～8 d在腋下長(zhǎng)出可見(jiàn)腫瘤，差異顯著。

2.3 腫瘤生長(zhǎng)情況

實(shí)驗(yàn)鼠均長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的移植瘤，外觀呈現(xiàn)不規(guī)則狀，質(zhì)地較硬，活動(dòng)性好，與周?chē)M織界限較清楚，并隨著時(shí)間的推移而逐漸增大。根據(jù)表1及圖1(腫瘤生長(zhǎng)曲線圖)顯示，接種第16天開(kāi)始，兩組實(shí)驗(yàn)鼠測(cè)得的腫瘤體積存在顯著差異(P< 0.05)，在成瘤后腫瘤生長(zhǎng)速率方面，GFP裸鼠腫瘤生長(zhǎng)速度比裸鼠要快；在接種第20天，裸鼠組測(cè)得體積約為(3463.43±341.39)mm3，GFP裸鼠組腫瘤體積約為(4923.46±521.72)mm3，存在顯著差異(P< 0.05)。據(jù)圖2可直觀的看出GFP裸鼠移植腫瘤生長(zhǎng)情況優(yōu)于裸鼠。圖1,圖2彩插4。

表1 GFP裸鼠與裸鼠皮下腫瘤的體積分析

2.4 腫瘤組織病理學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)鼠處死后，取瘤體觀察，均為球形結(jié)節(jié)狀，腫瘤為非浸潤(rùn)生長(zhǎng)；瘤體有完整的包膜包裹，與周?chē)M織分界清晰，容易分離，剖面呈魚(yú)肉狀，血供豐富，瘤塊中央可見(jiàn)局灶性壞死，GFP裸鼠瘤體體積比裸鼠瘤體更大一些。HE染色顯示腫瘤細(xì)胞排列緊密，瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，大小較為均勻，核質(zhì)深染，染色質(zhì)粗，部分區(qū)域可見(jiàn)腺腔形成。根據(jù)圖3、圖4所示(彩插4)，GFP裸鼠移植瘤瘤細(xì)胞比裸鼠瘤細(xì)胞排列更加緊密，可見(jiàn)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況更為活躍。腫瘤細(xì)胞分泌粘液，并侵犯周邊結(jié)締組織。

3 討論

腫瘤已成為當(dāng)前威脅人類(lèi)最嚴(yán)重的常見(jiàn)病之一，每年死于腫瘤的人數(shù)以百萬(wàn)計(jì)，因此，建立腫瘤模型，進(jìn)行防治研究，是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中的重要課題[2]。腫瘤模型對(duì)研究腫瘤的病因、發(fā)病機(jī)制、抗癌藥物篩選機(jī)腫瘤防治等具有非常重要的意義[3]。腫瘤分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展迫切需要簡(jiǎn)便快速、成瘤時(shí)間短和穩(wěn)定性好的動(dòng)物模型，以此作為研究平臺(tái)進(jìn)行后續(xù)的藥物或其他實(shí)驗(yàn)研究[4]。皮下移植瘤種植操作較為簡(jiǎn)便，創(chuàng)傷小，且易于測(cè)量瘤體直徑，因此本實(shí)驗(yàn)采取皮下移植瘤這一動(dòng)物模型制作方法進(jìn)行研究比較。理想的腫瘤動(dòng)物模型應(yīng)具備以下條件：(1)致癌方法簡(jiǎn)便易行；(2)經(jīng)濟(jì)快速；(3)指標(biāo)客觀明確；(4)對(duì)癌變器官的特異性高；(5)重復(fù)性好；(6)誘發(fā)腫瘤的病理類(lèi)型、生物學(xué)行為、電鏡下表現(xiàn)及組織化學(xué)改變應(yīng)與人體腫瘤相似[5]。結(jié)腸癌動(dòng)物模型也應(yīng)如此。

本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞懸液直接腋窩皮下注射的方法分別構(gòu)建了GFP裸鼠及裸鼠結(jié)腸癌動(dòng)物模型。GFP裸鼠組與裸鼠組均未見(jiàn)死亡，平均成瘤率100%，GFP裸鼠組于接種后4～5 d在右前肢腋窩皮下長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的腫瘤，裸鼠組于接種后6～8 d在腋下長(zhǎng)出可見(jiàn)腫瘤，存在顯著差異。隨著后期瘤體的增大，兩組均出現(xiàn)進(jìn)食，活動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍等現(xiàn)象，GFP裸鼠組的精神狀態(tài)較裸鼠組稍好一些。從接種第16天開(kāi)始，兩組實(shí)驗(yàn)鼠測(cè)得的腫瘤體積存在顯著差異(P< 0.05)，在接種第20天，裸鼠組測(cè)得體積約為(3463.43±341.39)mm3，GFP裸鼠組腫瘤體積約為(4923.46±521.72)mm3，存在顯著差異(P< 0.05)。根據(jù)腫瘤生長(zhǎng)曲線，可直觀顯示成瘤后腫瘤生長(zhǎng)速率方面，GFP裸鼠腫瘤生長(zhǎng)速度比裸鼠要快。這些數(shù)據(jù)與廖前進(jìn)[6]等報(bào)道的數(shù)據(jù)存在差異，可能與小鼠的品種，測(cè)量方法及生長(zhǎng)環(huán)境等有關(guān)。

綜上所述，可見(jiàn)GFP裸鼠在成瘤時(shí)間，精神狀態(tài)，腫瘤質(zhì)量等方面與裸鼠相比，具有一定的優(yōu)勢(shì)，腫瘤生長(zhǎng)曲線圖也可直觀的看出GFP裸鼠組腫瘤生長(zhǎng)情況優(yōu)于裸鼠組。由于GFP裸鼠將綠色熒光蛋白基因?qū)隑ALB/c nude小鼠，使得自身含有標(biāo)記蛋白，綠色熒光蛋白基因的導(dǎo)入可能改變了GFP裸鼠的蛋白表達(dá)，造成GFP裸鼠免疫功能與裸鼠比更為低下，還有待以后的進(jìn)一步比較研究。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)比較研究，我們可以看出GFP裸鼠較裸鼠而言，可為結(jié)腸癌淋巴轉(zhuǎn)移的機(jī)制探討和診斷治療研究提供更為理想的動(dòng)物模型。

參考文獻(xiàn)：

[1] 梁文豐，鄭琳，馮韻恬，等. PDTX裸鼠模型研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)科技論文在線精品論文. 2014,7(5)：398-402.

[2] 趙勇，伍靜，毛峰峰，等. 裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)問(wèn)題的解析和總結(jié)[J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志. 2012,22(7)：17-20.

[3] 李桂園，陳龍邦、臧靜，等. C57BL/6小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞株在ICR小鼠腫瘤模型的建立[J]. 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào). 2003,16(4)：262-266.

[4] 唐楊琛，沈干，胡世蓮，等. 兩種方法建立人胃癌裸鼠移植瘤模型的比較[J]. 中國(guó)臨床保健雜志. 2013，16(2)：180-182.

[5] 李友堂，李鴻茹，陳穎，等. 人肺腺癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立[J]. 福建醫(yī)藥雜志. 2010,32(1)：80-82.

[6] 廖前進(jìn)，蘇堅(jiān)，何潔，等. DADS對(duì)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞裸鼠致瘤的影響[J]. 實(shí)用癌癥雜志. 2010,25(3)：225-227.