秦 瑤，程樹軍，黃健聰，黃 玲，陳 彧

(1. 廣東出入境檢驗檢疫技術(shù)中心,廣州 510623; 2. 新疆出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，烏魯木齊 830063)

歐盟化妝品動物實驗禁令的發(fā)布和實施，為檢測機構(gòu)在產(chǎn)品安全性評價中建立科學合理的體外替代方法提出了要求。既然化妝品眼刺激評價的Draize兔眼試驗已被法規(guī)禁止，那么在多種有效的體外方法中選擇建立整合應(yīng)用策略是比較理想的模式，這些方法包括離體雞眼試驗(ICE)、雞胚絨毛膜尿囊膜試驗(HET-CAM、CAMVA、CAMTB)、牛角膜渾濁及通透度試驗(BCOP)、短時間暴露試驗(STE)、熒光素漏出試驗(FL)等[1-3]。本實驗研究組合兩種有效的眼刺激體外方法——雞胚絨毛膜尿囊膜血管試驗(CAMVA)和BCOP試驗，對60種個人護理產(chǎn)品眼刺激性進行評價，并與動物實驗進行比對，建立CAMVA-BCOP組合策略，為個人護理用品的眼刺激性的體外評價提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 樣品

市售化妝品合計60種，分為3類，清潔沐浴類產(chǎn)品(沐浴露、洗發(fā)水、清潔液等)22種，眼部用產(chǎn)品(粉底、眼線、眼霜、睫毛膏、眉筆等)17種和護膚類產(chǎn)品(防曬霜、防皺霜、祛斑、植物精油等)21種。

1.2 主要材料、試劑及儀器

SPF級白萊杭雞受精雞胚(購于新興大華農(nóng)禽蛋有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK(粵)2008-0019，牛眼球取自廣州地區(qū)屠宰場，普通級實驗兔購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心(實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK(粵)2008-0002。含酚紅及不含酚紅MEN培養(yǎng)基(含1% FBS和L-谷氨酰胺)、HBSS、熒光素鈉均購自Sigma公司，含Ca2+、Mg2+的DPBS，10%氫氧化鈉(廣州化學試劑廠)，“O”形特富龍環(huán)(孔徑0.8 mm)，角膜濁度儀(德國BASF-OP3.0)，全波長酶標儀(美國Thermo)，培養(yǎng)箱(德國Memmert)等。

1.3 CAMVA方法及眼刺激性分類

將1 d齡雞胚置于培養(yǎng)箱37℃孵育，于第4天在雞胚窄端鉆一小孔，抽取約3 mL蛋清后用火膠棉封住小孔。在雞胚位置的上方開約5 mm×10 mm的矩形小窗并移除蛋殼，暴露雞胚，以保鮮膜覆蓋。隨后放回培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育。第14天，取出雞胚，擴大觀察窗，于絨毛尿囊膜上放置“O”形特富龍環(huán)，取40 μL(固體40 mg)不同濃度受試物加入環(huán)內(nèi)，37℃孵育。30 min后，觀察血管變化，計數(shù)陽性反應(yīng)(出現(xiàn)溶血、血管消失、血管凝固等)雞胚個數(shù)，最后計算RC50，即引起一半雞胚出現(xiàn)陽性反應(yīng)的受試物濃度。如果樣品RC50>3%，判定為無刺激性，≤3%，則為有刺激性[4]。

1.4 BCOP方法及眼刺激性分類

參考OECD指南437，取新鮮牛眼球切取角膜，將其裝配于專用支架中。前后室均填滿無酚紅MEM，于(32±1)℃培養(yǎng)箱平衡1 h后用濁度儀讀數(shù)角膜濁度本底值。移除前室培養(yǎng)基后加入750 μL未稀釋液體受試物(固體為20%懸液)，孵育10 min(固體為4 h)，用含酚紅MEM沖洗至樣品無殘留。前室重新填滿無酚紅MEM后返回培養(yǎng)箱孵育2 h(固體無需后孵育)后讀取終末濁度值。去除前室培養(yǎng)基，加入1 mL 0.4%(固體為0.5%)由含Ca2+、Mg2+DPBS配制的熒光素鈉溶液，孵育90 min。收集后室全部液體，混勻后取360 μL在490 nm波長下讀取吸光度值。根據(jù)公式計算體外刺激評分值(in vitro irritancy score, IVIS)：IVIS=濁度值 + 15 × 吸光度。每個樣品重復(fù)3個角膜。IVIS≤3，預(yù)測無刺激性，3～55預(yù)測刺激性(包括2A和2B類)，>55預(yù)測嚴重刺激性[5]。

1.5 Draize兔眼試驗

成年健康家兔，在其中一只眼睛結(jié)膜囊滴入0.1 mL受試物，另一只眼睛作為對照，于染毒后24 h、48 h、72 h、4 d、7 d觀察眼睛結(jié)膜、角膜、虹膜反應(yīng)。根據(jù)改良最大平均得分MMAS (modified maximum average score)進行分類：MMAS≤2.5為無刺激性， 2.5～25為輕刺激性，25～50為中度刺激性，>50為嚴重刺激性/腐蝕性。

1.6 統(tǒng)計學方法

比較不同方法結(jié)果對物質(zhì)分類是否具有一致性，采用Kappa一致性檢驗 (Kappa≥0.75一致性好；0.75

2 結(jié)果

60種產(chǎn)品的體外測試和動物測試結(jié)果見表1。經(jīng)Draize試驗的樣品，結(jié)果為42種無刺激性，11種微弱刺激性、5種中等刺激性和2種嚴重刺激性。CAMVA試驗結(jié)果為41種無刺激性，19種為有刺激性；BCOP試驗結(jié)果為35種無刺激性，21種輕-中刺激性，4種嚴重刺激性。

以體內(nèi)實驗為判斷標準，參考替代方法驗證的準則[2]。CAMVA方法可以區(qū)分41種無刺激性樣品，特異性為97.6%(41/42)，可區(qū)分全部18種有刺激性的樣品，敏感性為100%(18/18)，但對刺激程度的預(yù)測效果不理想，總的分類一致性達到98.3%(59/60)，Kappa=0.890。陽性預(yù)測性為94.7%(18/19)，陰性預(yù)測率為100%(41/41)，假陽性率為2.4%(1/42)，假陰性率為0%(0/18)。

BCOP方法對于陽性結(jié)果的預(yù)測，總敏感性為100%(18/18)，其中嚴重/腐蝕性刺激性預(yù)測，敏感性為100%(2/2)，對于中度-輕度刺激性的區(qū)分，敏感性為95.8%(14/16)。BCOP可以區(qū)分35種無刺激性樣品，特異性為83.3%(35/42)。總的分類一致性達到85%(51/60)，其中陽性預(yù)測性(含輕度,中度和嚴重刺激性)為72%(18/25)，陰性預(yù)測性為100%(35/35)。假陽性率為20.0%(7/35)，假陰性率為0%(0/18)。分類不一致的情況是將1種輕度和1種中度刺激性誤分類為嚴重刺激性，7種無刺激性誤分類為輕-中度刺激嚴重刺激性。

試驗結(jié)果表明，CAMVA區(qū)分了41種無刺激性樣品，18種有刺激性樣品，與兔眼試驗一致性達到98.3%(59/60)，但對于有刺激性樣品并無確切的程度對應(yīng)區(qū)分。BCOP鑒別了35種無刺激性樣品和25種有刺激性樣品，總的分類一致性為85%，一致性檢測Kappa=0.743，低于CAMVA法，主是原因是BCOP方法將較多的無刺激類歸為不可預(yù)測類。采用CAMVA-BCOP的組合方法(表2)：對于陽性結(jié)果的預(yù)測總敏感性為100%(18/18)，其中嚴重刺激性預(yù)測敏感性為100%(2/2)，對于中度-輕度刺激性的區(qū)分，敏感性為100%(15/15)，對于無刺激性樣品預(yù)測的特異性為97.6%(41/42)?？偟姆诸愐恢滦赃_到98.3%(59/60)，其中陽性預(yù)測性為100%(18/18)，陰性預(yù)測性為100%(35/35)。假陽性率為2.4%(1/42)，假陰性率為0%(0/18)。

表1 體內(nèi)和體外實驗結(jié)果

表2 組合方法實驗結(jié)果

圖1 組合CAMVA-BCOP方法的眼刺激試驗策略

3 討論

傳統(tǒng)Draize兔眼試驗存在評分主觀性、重復(fù)性差、耗時、方法殘忍等不足，無法滿足產(chǎn)品精確定量評價的要求。近20多年來，已開發(fā)了多種體外方法用于替代兔眼試驗，不僅可以減少體內(nèi)試驗的不足，而且遵循了動物實驗減少優(yōu)化和替代的3R原則。但是，鑒于體內(nèi)眼刺激反應(yīng)尚包括眼瞼、結(jié)膜和角膜的反應(yīng)，僅使用單一體外方法無法完全模擬體內(nèi)反應(yīng)，不同方法適用范圍也存在差異，體外方法還不能很好地檢測損傷后的修復(fù)作用。因此考慮組合兩個或兩個以上體外方法建立整合測試策略，以覆蓋眼刺激性反應(yīng)累及的范圍和程度。

雞胚絨毛膜毛尿囊膜結(jié)構(gòu)與眼結(jié)膜相似，CAMVA方法通過觀察受試物對血管的作用評價潛在的眼刺激性，具有較高的敏感性[6]。對于檢測中度以下的眼刺激性效果較好，尤其是能有效區(qū)分無刺激性物質(zhì)[7]，但對輕度刺激性以上的物質(zhì)無法精確區(qū)分。其不足之處還表現(xiàn)在對含聚氧乙烯配方的檢測中容易導致假陽性結(jié)果[6]，實驗持續(xù)時間較長，對不溶物質(zhì)的操作要求較高等。該方法適合作為化妝品和個人護理用品配方、醇類物質(zhì)和表面活性劑的刺激性篩查[2,5]。

BCOP以離體牛眼角膜模擬人角膜進行受試物暴露，通過測量角膜渾濁度及滲透性的改變評價受試物眼物刺激性[8]。其優(yōu)點在于不受樣品理化性質(zhì)和溶解性的限制，可用于化學品眼刺激標識和分類，還可以延長角膜培養(yǎng)時間和增加角膜組織學檢查以評估刺激損傷后的恢復(fù)作用和機制分析。缺點是只評估了角膜損傷，沒有考慮受試物對虹膜和結(jié)膜的刺激作用[9]。BCOP法于2009年被OECD認可發(fā)布為試驗指南(TG 437)，用于嚴重刺激性和腐蝕性的鑒別，2013年重復(fù)修訂的版本，確定了其在鑒別無刺激性中的作用[4]。

本研究結(jié)果表明，采用CAMVA-BCOP的組合方法可明顯提高眼刺激性預(yù)測的一致性和敏感性，彌補單一方法的不足，達到替代體內(nèi)實驗的目的。如果了解產(chǎn)品成分或配方結(jié)構(gòu)，替代方法的組合應(yīng)用特別具有優(yōu)勢。如何選擇方法組合及其順序應(yīng)綜合考慮評估目的和樣品特性等因素，例如美國EPA推薦采用BCOP法、細胞傳感器法和重建角膜模型(EpiOcular)的組合策略，用于抗菌劑眼刺激性的檢測[3]。Donahue等人建立了基于化妝品配方優(yōu)化的CAMVA和BCOP的組合方法[10]。日本學者建立了STE與BCOP方法的組合評價化合物的眼刺激性[11]。本研究建立CAMVA-BCOP整合方案適用于個人護理用品的測試，主要考慮到大部分樣品眼刺激性較溫和，而且劑型多樣，配方多變的特點，實驗順序采用先CAMVA后BCOP的組合。如果是工業(yè)化學品，關(guān)注的是化學物刺激性的準確標識和分類，眼刺激性波動范圍可能較大，可在預(yù)判的基礎(chǔ)上，選擇BCOP單一方法測試或選擇先BCOP后CAMVA的組合[12]。根據(jù)新版的OECD指南，BCOP可以有效鑒別刺激譜兩端的樣品，配合敏感性高的CAMVA，這一組合可解決大部分樣品眼刺激性檢測的需要，建議的測試程序如圖1。相信隨著更多標準化的眼刺激替代方法的研發(fā)，以及針對不同測試目的建立組合方案的探索和驗證，有希望進一步提高眼刺激性預(yù)測的科學性。

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