孕哺期暴露NP對子代大鼠腦組織基因表達譜的影響*

許 潔，汪 洋，楊孟雪，蔣智鋼，萬齊友，庹芳旭，封校亞，俞 捷

(1.重慶醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院, 重慶 400016；2. 遵義醫(yī)學院 公共衛(wèi)生學院, 貴州 遵義 563099；3. 遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科，貴州 遵義 563099 )

基因芯片技術(shù)是20 世紀 90 年代迅速發(fā)展起來的分子生物學技術(shù)，它在疾病發(fā)生機制和臨床診斷等許多生命科學領域已得到廣泛的應用，具有快速、準確、多樣性、微型化和自動化等優(yōu)點[1-4]。目前，基因芯片技術(shù)在神經(jīng)毒理學中的應用還屬于初始階段，本研究應用基因芯片技術(shù)篩選暴露仔鼠模型海馬組織的差異表達基因，擬在基因水平揭示Nonylphnol (NP) 引起仔鼠學習記憶能力降低的可能作用機制。

結(jié)合在前期實踐過程中遇到的若干問題，遵循對照長江經(jīng)濟帶發(fā)展和生態(tài)文明建設的新要求，本文從頂層設計、系統(tǒng)治理、綠色發(fā)展、科技與制度改革創(chuàng)新、水生態(tài)文明意識培育五個方面探索提出對城市水生態(tài)文明建設的對策建議。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及染毒 選取清潔級Sprague Dawley大鼠性成熟個體，雄鼠15只，雌鼠30只，按雌：雄2：1同籠交配(由第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供：SCXK(渝)20070005)，獲取妊娠雌性SD鼠后隨機分為NP組與對照組，于妊娠第6天到出生后21 d灌胃NP和花生油, NP 純度99%(購于東京化成株試會社)。

1.2.2 差異表達基因的篩選 原始數(shù)據(jù)用FastQC檢測數(shù)據(jù)質(zhì)量，使用Tophat進行“序列比對”，再由Cufflink系列軟件分析陰性對照組和miR-1254模擬體組的DEG。其中，以倍數(shù)變化(fold change，F(xiàn)C)表示單個基因表達變化的倍數(shù)。以q<0.05且|log FC|≥1考慮差異有統(tǒng)計學意義。

1.2 樣品的合并 NP實驗組和對照組21 d仔鼠累積取樣各10個，于盛有液態(tài)氮的金屬溶器中進行樣品合并，放液氮罐中備用。

2.3.1.1 分子功能(molecular function)差異表達基因主要涉及的分子功能：結(jié)合活性(binding activity)有158個基因上調(diào)、催化活性(catalytic activity)有83個基因上調(diào)、核酸結(jié)合活性(nucleotide binding)有55個基因上調(diào)，嘌呤核苷酸結(jié)合活性(purine ribonucleotide binding)有50個基因上調(diào)等(見圖1)。

1.5 差異基因GO(Gene Ontology)分析 GO是基因及基因產(chǎn)物的功能分類體系，分為分子功能(Molecular Function)、生物過程(Biological Process)和細胞組成(Cellular Component)3個部分。

1.4 表達譜芯片雜交及掃描 芯片雜交與洗滌委托上?？党煽萍加邢薰就瓿?。大鼠表達譜芯片采用Roche NimbleGen(NimbleGen Systems, Inc., USA)的12x135K芯片，每張芯片可檢測26,419個基因，芯片晾干后，結(jié)果采用Axon GenePix 4000B 芯片掃描儀，掃描文件導入GenePix Pro 6.0分析軟件。

2 結(jié)果

2.1 腦組織RNA提取及質(zhì)量鑒定結(jié)果 對照組和實驗組樣本提取的總RNA，經(jīng)核酸濃度測定儀檢測，特定波長的光密度值A260/A280比值在1.9～2.1，A260/A230 比值大于1.8，表明提取的總RNA無降解，符合實驗要求，且mRNA總量達到芯片分析要求(見表1)。

表1壬基酚暴露和未暴露組腦組織RNA提取及質(zhì)量鑒定結(jié)果

組別OD260/280OD260/230濃度 (ng/μL)對照組2.042.351721.97處理組 2.062.282024.5

2.2 差異表達基因 暴露組與對照組共檢測26 419個基因，芯片結(jié)果有1 254個差異表達基因，其中619個基因上調(diào)，635個基因下調(diào)。與神經(jīng)系統(tǒng)功能相關差異表達基因大致為幾方面：周圍神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關基因，神經(jīng)膠質(zhì)細胞發(fā)育基因，細胞增殖與分化，細胞凋亡，免疫應答，炎癥反應因子，細胞信號傳導等方面。

2.3.1.3 細胞組成(cellular component) 表達上調(diào)基因的表達產(chǎn)物所涉及細胞成分：胞外區(qū)(extracellular region)有27個基因、高爾基體部分(Golgi apparatus part)有8個基因、中間纖維(intermediate filament)有5個等(見圖3)。

2.3 基因功能分類

2.3.1 上調(diào)基因功能分類

有一個大胡子照相師曾經(jīng)騎著一匹棗紅馬來我們村。他第一次來，我以為是您回來了。那天，我遠遠看見他，不知道怎么就跑上去，問他認不認識一杭。我很希望他說認識。但他說不認識。還反問我認識嗎？不過，我還是很喜歡他，他有很粗很黑的胡子，看上去特別威風。爸爸，您也要為我留一把大胡子。

1.3 總RNA的提取及鑒定 用TRIzol提取NP暴露組和對照組腦組織總RNA，紫外分光光度計檢測0D值，要求A260/A280比值介于1.8～2.1,A260/A230 比值大于1.8。

2.3.2 下調(diào)基因功能分類

小兒急性上呼吸道感染是臨床常見的小兒疾病,可見于任何季節(jié),鼻病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒等是引起本病的主要病原菌,患兒臨床多表現(xiàn)為噴嚏、咽部充血、發(fā)熱等癥狀。

然后，飼料廠要注重生物安全。在不使用時做好密封，有效地控制害蟲，防止灰塵收集系統(tǒng)中的灰塵再循環(huán)回到飼料中，并管理好整個工廠的人員移動。

2.3.1.2 生物過程(biological process)表達上調(diào)基因參與的主要生物學過程：大分子代謝過程(macromolecule metabolic process)有102基因上調(diào)，細胞大分子代謝過程(cellular macromolecule metabolic process) 有92基因上調(diào),蛋白代謝過程(protein metabolic process)有62個基因上調(diào)等(見圖2)。

2.3.2.1 分子功能(molecular function)表達下調(diào)基因經(jīng)GO分析，分子功能主要分類：結(jié)合活性(binding activity)有266個基因下調(diào)、催化活性(catalytic activity)有153個基因下調(diào)、金屬離子結(jié)合活性(metalion binding)有95個基因下調(diào)、離子結(jié)合活性(ion binding)有95個基因下調(diào)，陽離子結(jié)合活性(cation binding)有95個基因下調(diào)等(見圖4)。

圖1 差異表達上調(diào)基因分子功能的分類 圖2 差異表達上調(diào)基因參與的生物過程分析

圖3 差異表達上調(diào)基因表達產(chǎn)物的細胞組成分析 圖4 差異表達下調(diào)基因的分子功能分類

2.3.2.2 生物過程(biological process)從下調(diào)表達基因參與的生物學過程分析結(jié)果來看，下調(diào)基因參與的主要生物學過程： 細胞代謝過程(cellular metabolic process)有179個基因下調(diào)，代謝過程(metabolic process) 有209個基因，氮化合物代謝過程(nitrogen compound metabolic process)有110個基因，細胞氮化合物代謝過程(cellular nitrogen compound metabolic process) 有108個基因，核苷堿基、核苷、核苷酸及核酸代謝過程(nucleobase, nucleoside, nucleotide and nucleic acid metabolic process)有100個基因，發(fā)育過程(developmental process)有88個基因等(見圖5)。

2.3.2.3 細胞組成(cellular component)表達下調(diào)基因的表達產(chǎn)物所涉及細胞成分：細胞內(nèi)(intracellular)有280個基因，細胞內(nèi)部分(intracellular part)有264個基因，細胞器(organelle)有231個基因，細胞器部分(intracellular organelle)有228個基因，膜結(jié)合細胞器(membrane-bounded organelle)有204個基因，細胞質(zhì)(cytoplasm)有203個基因等(見圖6)。

圖5 差異表達下調(diào)基因參與的生物過程分析 圖6 差異表達下調(diào)基因表達產(chǎn)物的細胞組成分析

3 討論

胚胎期和哺乳期是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能形成期，外界有害因素的影響可導致腦功能嚴重缺損。有研究報道NP可導致對小鼠神經(jīng)毒性作用[5-6]，NP和雌二醇[7]或雙酚A[8]孕哺期聯(lián)合染毒能使猴和鼠子代行為發(fā)生改變，但有關NP影響腦發(fā)育的機制目前還不十分清楚。目前國外有報道將基因表達譜芯片分析技術(shù)引入環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的體外實驗研究[9-11]，有關環(huán)境內(nèi)分泌干擾物NP對仔鼠神經(jīng)發(fā)育影響的基因表達譜分析的研究報道較少，關于NP對5日齡子代睪丸以及腦組織的芯片表達譜的研究表明[12-13]：NP對發(fā)育中的腦組織有關酶類、神經(jīng)遞質(zhì)會產(chǎn)生不利影響，也可通過激活caspase-3誘導神經(jīng)干細胞的凋亡。本實驗采用表達譜芯片檢測兩組差異基因，根據(jù)篩選出來的差異表達基因參與的信號通路，為我們進一步有針對性的探索NP神經(jīng)毒性的機制研究提供方向。

GO分析即基因本體論分析，表達譜芯片篩選的差異表達基因通過GO分析，可得知差異表達基因主要功能。本實驗的GO(Gene Ontology)分析顯示：差異表達基因主要涉及的分子功能有結(jié)合活性、金屬離子結(jié)合活性、催化活性、核酸結(jié)合活性等；參與的主要生物學過程有細胞大分子代謝過程, 細胞氮化合物代謝過程、核苷酸及核酸代謝過程、蛋白代謝過程；所涉及細胞成分包括胞外區(qū)、細胞器、高爾基體部分、細胞質(zhì)、中間纖維等。目前尚無有關NP及其它的內(nèi)分泌干擾物對成熟期仔鼠腦組織的基因表達譜的報道，故無借鑒資料進行比較，只能對差異表達基因中，現(xiàn)已明確功能的部分基因及表達產(chǎn)物的相關蛋白進行分析，對定位和功能不明的基因，暫不能進行分析，但可為NP對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育影響機制的研究提供了極為重要的線索，隨著未知基因功能逐步明確，將對逐步弄清NP對神經(jīng)系統(tǒng)分化發(fā)育的損傷機制具有重要的意義。

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