袁 偉，方 杰，瓦慶彪，陳前明

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 皮膚科，貴州 遵義 563099；2.成都市第二人民醫(yī)院 皮膚科，四川 成都 610017)

端粒酶活性增強(qiáng)可導(dǎo)致細(xì)胞永生化、腫瘤形成。內(nèi)源性端粒酶抑制基因PinX1(PIN2/TERF1 interacting, telomerase inhibitor 1)基因是在人類細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)能與端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT(human telomerase reverse transcriptase)直接相互作用的端粒酶/端粒調(diào)控因子，能下調(diào)端粒酶活性，縮短端粒長(zhǎng)度，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，被推測(cè)為潛在的抑癌基因。目前已發(fā)現(xiàn)PinX1在人類包括肝癌、膀胱癌、肺癌、鼻咽癌、食管癌等多種腫瘤中的表達(dá)明顯降低或無表達(dá)[1-3]，而且在皮膚腫瘤中已有研究表明端粒酶活性高于正常皮膚組織[4]。本研究旨在通過檢測(cè)PinX1、hTERT在基底細(xì)胞癌(basal cell carcinomas，BCC)、鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)中的表達(dá)，探討PinX1、hTERT在BCC、SCC發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本資料 實(shí)時(shí)定量PCR應(yīng)用新鮮組織標(biāo)本，采集2012年3月至2013年3月遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及成都第二人民醫(yī)院手術(shù)標(biāo)本，包括BCC13例(男5例，女8例，年齡40～88歲，平均56.85±15.07歲)、SCC22例(男10例，女12例，年齡51～93歲，平均68.68±12.67歲)及正常皮膚組織15例(男性9例，女性6例，年齡22～65歲，平均39.66±11.85歲)。取材部位：頭、面、四肢、軀干。所有標(biāo)本采集離體10 min內(nèi)置入凍存管內(nèi)，放入-80 ℃低溫冰箱保存。免疫組化石蠟標(biāo)本為遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及成都市第二人民醫(yī)院2008年12月至2012年6月明確診斷的病變組織石蠟標(biāo)本。取材部位：頭、面、四肢、軀干。其中30例BCC(男11例，女19例，年齡40～84歲，平均65.33±11.91歲)、46例SCC(男21例，女25例，年齡41～95歲，平均66.63±11.99歲)及正常皮膚組織17例(男8例，女9例，年齡15～60歲，平均38.54±14.12歲)。研究對(duì)象選擇標(biāo)準(zhǔn)如下：①基底細(xì)胞癌及鱗狀細(xì)胞癌均有典型或較為典型的皮損，術(shù)前均未經(jīng)放療、光動(dòng)力治療以及其它特殊治療，經(jīng)皮膚病理檢查證實(shí)具有其相應(yīng)的典型病理改變；②對(duì)照組正常皮膚為接受美容或整形外科手術(shù)的個(gè)體，均無免疫性疾病和系統(tǒng)性疾病。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 實(shí)時(shí)定量PCR主要試劑：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系試劑盒(大連TakaPa公司)、SYBR Green I嵌合熒光法試劑盒(大連TakaPa公司)、PinX1與hTERT引物及內(nèi)參還原磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物均由上海Sangon公司設(shè)計(jì)合成，引物序列(見表1)。免疫組化主要試劑：兔抗人PinX1多克隆抗體(美國(guó)Assay生物公司)、兔抗人TERT多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、PV-9000免疫組化染色試劑盒 (北京中杉金橋生物公司)、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物公司)。PinX1多克隆抗體工作液濃度為1∶75，hTERT多克隆抗體工作液濃度為1∶200。

表1 PinX1、hTERT及GAPDH引物序列

基因引物長(zhǎng)度PinX1Forward: 5'-GGTGGTCTAAAG-GAAAGGGTTT-3'Reverse: 5'-ATGGGCAATCCAGTTGTCTT-3'127hTERTForward: 5'-CTCCCATTTCATCAGCAAGTTT-3'Reverse: 5'-CTTGGCTTTCAGGATGGAGTAG-3'96GAPDHForward: 5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'Reverse: 5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'258

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR ①提取總RNA，合成cDNA：取組織100 mg采用Trizol一步法提取組織內(nèi)總RNA。所提取的總RNA用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280含量并檢測(cè)其純度，1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。篩選所有比值在1.8～2.0且無降解的樣品，取2 μg總RNA按逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系試劑盒說明合成cDNA。cDNA放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。②擴(kuò)增及電泳：以cDNA為模板，利用Bio-RAD熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-RAD公司)按照SYBR Green I嵌合熒光法試劑盒說明書檢測(cè)PinX1、hTERT基因mRNA在基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌及正常皮膚組織中的表達(dá)。擴(kuò)增反應(yīng)條件：PinX1 PCR：預(yù)變性95 ℃10 s，1個(gè)循環(huán)：變性95 ℃10 s，退火(復(fù)性)55 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)；GAPDH PCR：預(yù)變性95 ℃10 s，1個(gè)循環(huán)；變性95 ℃10 s，退火60 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)；hTERT PCR：預(yù)變性95 ℃10 s，1個(gè)循環(huán)；變性95 ℃10 s，退火60 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-△△ct法對(duì)有特異性擴(kuò)增的目的基因進(jìn)行相對(duì)定量。反應(yīng)結(jié)束后分析PCR擴(kuò)增曲線及熔解曲線，并進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)擴(kuò)增特異性。

1.3.2 免疫組化 石蠟標(biāo)本4 μm連續(xù)切片。采用免疫組化SP法，行pH6.0檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)抗原，具體方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。DAB顯色，蘇木精復(fù)染。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。PinX1免疫組化結(jié)果以胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性；hTERT免疫組化結(jié)果以胞核或(和)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性。染色范圍以免疫染色最多的區(qū)域，每個(gè)標(biāo)本在400倍圖像下等距隨機(jī)選10個(gè)視野，按一定順序計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率并評(píng)分：基本無染色為0分，淺棕黃色為1分，棕色為2分，棕褐色為3分；著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分率≤5%為0分，6%～30%為1分，3l%～60%為2分，>61%為3分。評(píng)分=著色程度得分×著色細(xì)胞百分率得分。<2分為陰性(-)，≥2分為陽(yáng)性(+)[5]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析；免疫組化實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間陽(yáng)性表達(dá)率比較采用2檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析，兩樣本相關(guān)性分析用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

2.1.1 總RNA純度和完整性 A260/A280樣本比值在1.8～2.0，提示總RNA純度良好；在紫外線燈下可見28S、18S和5S三條大小和比例合適的條帶，表明提取的總RNA無降解。

2.1.2 PinX1及hTERT mRNA的表達(dá)水平 PinX1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖在127bp處可見明顯的電泳條帶，hTERT基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖在96 bp處可見明顯的電泳條帶，GAPDH基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖在258bp處可見明顯的電泳條帶(見圖1)。

注：M為DNA Marker 2000；1、2、3為PinX1擴(kuò)增片斷(127bp)；4、5、6為GAPDH擴(kuò)增片斷(258bp)；7、8、9為hTERT擴(kuò)增片斷(96bp)。 圖1 PinX1、GAPDH和hTERT電泳圖

2.1.3 PinX1及hTERT基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量 BCC、SCC組織中PinX1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，BCC與SCC組織中PinX1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；BCC、SCC組織中hTERT mRNA的相對(duì)表達(dá)量均高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，BCC與SCC組織中hTERT mRNA的相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

組別例數(shù)PinX1hTERTBCC132.26±1.38*5.90±2.94*SCC222.68±1.71*6.28±4.01*Control154.25±2.021.62±0.99

注：*：與對(duì)照組相比，P<0.05。

2.2 免疫組化結(jié)果

2.2.1 BCC、SCC組織中PinX1蛋白的表達(dá) PinX1蛋白陽(yáng)性產(chǎn)物主要定位于胞核，SP染色呈粗細(xì)不一的棕黃色顆粒。正常皮膚組織中PinX1蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)(見圖2A)?；准?xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌中，可見到PinX1蛋白呈不同程度的表達(dá)(見圖2B、2C)。兩組PinX1陽(yáng)性表達(dá)率均明顯低于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(基底細(xì)胞癌與鱗狀細(xì)胞癌組織PinX1陽(yáng)性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=0.241，P>0.05,見表3)。

表3 PinX1蛋白在皮膚腫瘤組織和正常皮膚組織中的表達(dá)

組別例數(shù)PinX12PBCC306(20.0)9.3930.002SCC466(13.04)14.2950.000Nor-mal1711(64.7)

注：A：PinX1蛋白在正常皮膚組織中的表達(dá)；B：PinX1蛋白在BCC組織中的表達(dá)；C：PinX1蛋白在SCC組織中的表達(dá)；D：hTERT蛋白在正常皮膚組織中的表達(dá)；E：hTERT蛋白在BCC組織中的表達(dá)；F：hTERT蛋白在SCC組織中的表達(dá)。 圖2 PinX1、hTERT蛋白在各組組織中的表達(dá)(SP ×100)

2.2.2 BCC、SCC組織中hTERT蛋白的表達(dá) hTERT蛋白陽(yáng)性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞核或(和)細(xì)胞漿中，SP染色呈棕黃色顆粒。正常組織中多數(shù)hTERT表達(dá)呈陰性(見圖2D)?；准?xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌中，hTERT蛋白均有表達(dá)(見圖2E、2F)，其陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌之間hTERT蛋白陽(yáng)性表達(dá)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=0.163，P>0.05,見表4)。

表4 hTERT在皮膚腫瘤組織和正常皮膚組織中的表達(dá)

組別例數(shù)hTERT2PBCC3019(63.3)11.6750.001SCC4627(58.7)11.0050.001Nor-mal172(11.8)

2.2.3 PinX1與hTERT蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析 通過對(duì)PinX1與hTERT蛋白在組織中的陽(yáng)性表達(dá)及陰性表達(dá)例數(shù)進(jìn)行Spearman等級(jí)相關(guān)分析，結(jié)果表明：基底細(xì)胞癌組織中二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.439，P<0.05)；鱗狀細(xì)胞癌組織中二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.476，P<0.05)；基底細(xì)胞癌及鱗狀細(xì)胞癌兩種皮膚腫瘤中二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.460，P<0.05)。

3 討論

端粒酶能以自身RNA為模板合成端粒DNA，并加至端粒末端以維持端粒長(zhǎng)度的穩(wěn)定，抵消因各種原因造成的端粒的縮短及不穩(wěn)定。正常人體細(xì)胞端粒酶活性缺乏，細(xì)胞分裂同時(shí)端粒就會(huì)相應(yīng)縮短，當(dāng)端?？s短到一定長(zhǎng)度時(shí)，保護(hù)染色體末端的功能喪失，最終導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡；而在腫瘤細(xì)胞中，端粒酶被重新活化，使端粒長(zhǎng)度穩(wěn)定，細(xì)胞因此逃過死亡而無限增殖，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞永生化[6-8]。

人端粒酶的主要組成為：①人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT);②端粒酶相關(guān)蛋白(telomerase associated protein, TP);③人端粒酶RNA(human telomerase RNA，hTR)。在端粒酶的活性起調(diào)控中，端粒酶催化亞單位TERT最為重要，是關(guān)鍵的限速酶，而端粒RNA及端粒酶相關(guān)蛋白均不能決定端粒酶活性[9]。hTERT為RNA依賴的DNA 聚合酶，可識(shí)別單鏈富含G的寡核苷酸引物，以其RNA組分的堿基為模板與端粒重復(fù)序列進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，在合成、延伸堿基序列中起催化作用[10]。

作為內(nèi)源性端粒酶抑制基因，PinX1基因由7個(gè)外顯子組成，有兩種轉(zhuǎn)錄形式，分別編碼174個(gè)氨基酸和328個(gè)氨基酸[11]。其定位于8p23，該區(qū)域同時(shí)也是一個(gè)在多種人類腫瘤中發(fā)生高頻雜合缺失(loss of heterozygosity，LOH) 的區(qū)域。有體外實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，PinX1與其端粒酶抑制結(jié)構(gòu)域TID可以與hTERT相互作用，下調(diào)端粒酶活性[11-12]。同時(shí)，PinX1還可依賴TERT結(jié)合端粒酶的RNA組分，阻斷端粒酶RNA，從而使其喪失活性，破壞其模板功能，從而抑制端粒酶活性[13-14]。

PinX1在正常人體組織內(nèi)廣泛存在，而在腫瘤組織中則低表達(dá)或者不表達(dá)[11]；hTERT在腫瘤組織中存在高表達(dá)，而在正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PinX1在基底細(xì)胞癌、皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平明顯低于正常組(P<0.05)，部分低表達(dá)或不表達(dá)，提示作為內(nèi)源性端粒酶抑制基因，PinX1可能參與皮膚組織細(xì)胞端粒酶活性的下調(diào)，維持細(xì)胞的正常凋亡，抑制腫瘤的生長(zhǎng)，由于PinX1的損傷或缺失，端粒酶在基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌組織中活化，使細(xì)胞永生化腫瘤生長(zhǎng)。hTERT在基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組(P<0.05)，hTERT作為端粒酶的活性調(diào)控關(guān)鍵的限速酶，其在基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌組織中呈高表達(dá)，提示端粒酶活性在基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌及日光性角化病組織中可能強(qiáng)于正常皮膚組織，hTERT的高表達(dá)可能促進(jìn)基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生?；准?xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌組織中PinX1表達(dá)和hTERT 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)二者可能存在著一定的拮抗，可能因?yàn)镻inX1下調(diào)，hTERT不能被有效結(jié)合并抑制，致使端粒酶活性增強(qiáng)，端粒長(zhǎng)度得到維持，因此細(xì)胞不能正常衰老或凋亡而無限增殖，從而導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)。

綜上所述，檢測(cè)PinX1和hTERT的表達(dá)可能對(duì)評(píng)價(jià)基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展有重要的臨床價(jià)值，PinX1、hTERT有可能成為基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌新的檢測(cè)指標(biāo)，而且通過調(diào)控PinX1、hTERT的表達(dá)可能成為治療基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌的一條新途徑。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 馬英玉,武良,李繼承.Pinx1表達(dá)與端粒酶活性及腫瘤的關(guān)系[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志, 2008,30(4):472-474.

[2] 賴肖芬,申聰香,文忠，等. 端粒酶抑制因子PinX1基因在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)及作用效應(yīng)分析[J].中國(guó)耳鼻咽喉顱底外科雜志, 2011,17(3):161-163.

[3] 左靜,王大虎,張祥宏，等.PinXl在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系[J].中國(guó)老年學(xué)雜志, 2012,32(1):259-260.

[4] Chen Z，Smith K J，Skelton H G，et al．Telomerase activity in Kaposi's sarcoma，squamous cell carcinoma，and basal cell carcinoma[J].Exp Biol Med， 2001，226(8)：753-757.

[5] 張晉卿,梁虹,王珊珊，等.Survivin和COX-2在鮑溫病和皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義[J].中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志, 2010,24(9):801-803.

[6] Grandin N，Charbonneau M. Protection against chromosome degradation at the telomeres[J].Biochimie， 2008，90(1)：41-59．

[7] Bianchi A, Shore D. How telomerase Reaches Its End: Mechanism of Telomerase Regulation by the Telomeric Complex [J]. Mol Cell, 2008,31(2):153-165.

[8] Rhyu M S. Telomeres, telomerase, and immortality[J]. J Natl Cancer Inst,1995,87(12):884-894.

[9] Marcia B， Christophe N. Regulation of Telomerase and Telomeres：Human Tumor Viruses Take Control [J]. J Natl Cancer Inst， 2008，100 (2)：98-108.

[10] Gillis A J, Schuller A P, Skordalakes E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT[J]. Nature, 2008,455(7213):633-637.

[11] Zhou X Z, Lu K P.The Pin2/TRF1-interacting protein PinX1 is a potent Atelomerase inhibitor[J]. Cell, 2001,107(3).347-359.

[12] Johnson F B. PinX1 the tail on the chromosome[J]. J Clin Invest， 2011，121(4)：1242-1244.

[13] Banik S S， Counter C M. Characterization of interactions between PinX1 and human telomerase subunits hTERT and hTR[J]. J Biol Chem， 2004，279(50)：51745-51748.

[14] Lin J, Blackburn E H.Nucleolar protein PinX1p regulates telomerase by sequestering its protein catalytic subunit in an inactive complex lacking telomerase RNA [J]. Genes Dev, 2004,18(4):387-396.

[15] Zang G , Miao L , Mu Y, et al. Adenoviral mediated transduction of adenoid cystic carcinoma by human TRAIL gene driven with hTERT tumor specific promoter induces apoptosis [J]. Cancer Biol Ther, 2009,8(10):966-972.