張 輝，崔煥忠，楊 歡，高云航，楊 倩，常曉博，尹 健，齊 磊，秦貴信

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是世界范圍內(nèi)給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的重要疫病之一，病死率高達(dá)20%-60%，于1996年在我國(guó)首次報(bào)道發(fā)生。豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratory syndromevirus，PRRSV）感染豬后可引起持續(xù)性感染，其原因可能為中和抗體產(chǎn)生較慢以及先天免疫反應(yīng)抑制的結(jié)果[1]。研究表明，在感染細(xì)胞和豬體內(nèi)PRRSV可以抑制I型IFN產(chǎn)生，本文對(duì)PRRSV抑制I型IFN機(jī)制進(jìn)行了簡(jiǎn)要闡述。

1 PRRSV對(duì)TLRs的表達(dá)及其信號(hào)通路的調(diào)控

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）在激活先天性免疫中發(fā)揮著重要作用，與控制病毒感染相關(guān)的有 TLR3、TLR7、TLR8和TLR9。以 poly（I:C）和PRRSV作用豬肺泡巨噬細(xì)胞（porcine alveolarmac?rophages，PAMs）和豬骨髓造血干細(xì)胞來源的幼稚樹突狀細(xì)胞，未刺激的PAMs中TLR3、TLR7和TLR8的表達(dá)高于幼稚樹突狀細(xì)胞；與之相反，PRRSV感染幼稚樹突狀細(xì)胞6 h后負(fù)調(diào)控TLR3、TLR7和TLR8表達(dá)，然而在感染后24 h，表達(dá)量又恢復(fù)到基本水平；poly（I:C）刺激PAMs促進(jìn)TLR3表達(dá)，抑制TLR7和TLR8表達(dá)。TLR3的激活導(dǎo)致抗PRRSV反應(yīng)增強(qiáng)，病毒增殖減少。截短了TLR3的TIR區(qū)域可促進(jìn)PRRSV在Marc-145中增殖，而未截短的TLR3則抑制PRRSV增殖，表明TLR3負(fù)調(diào)控病毒的增殖，對(duì)宿主抗PRRSV的先天性免疫起著重要作用[2]。poly（I:C）與LPS刺激PRRSV感染細(xì)胞，TLR4的表達(dá)均無(wú)變化，但TLR3的表達(dá)顯著降低。TLR3識(shí)別病毒dsRNA，間接激活I(lǐng)FN調(diào)控因子（IFN regulatory factor，IRF）3和IRF7，誘導(dǎo)IFN-α產(chǎn)生，PRRSV通過調(diào)控TLR3信號(hào)通路來調(diào)控IFN產(chǎn)生。

2 PRRSV通過IRF介導(dǎo)的RIG-I/MDA5通路靶向作用于IFN增強(qiáng)子

PRRSV感染Marc-145細(xì)胞對(duì)IFN-α和IFN-β的轉(zhuǎn)錄沒有影響，以tRNA處理后，IFN基因與增強(qiáng)子基因的mRNA表達(dá)均升高；然而PRRSV感染與tRNA 共同處理，IFN-α、IFN-β、ATF-2和IRF3顯著減少，這是由于PRRSV介導(dǎo)的抑制RIG-I信號(hào)通路。PRRSV激活NF-κB和AP-1通路，抑制IRF3 通路[3]。

PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白在抑制I型IFN方面發(fā)揮了重要作用。Nsp1α羧基末端14個(gè)氨基酸對(duì)于下調(diào)IFN-β和NF-κB表達(dá)水平至關(guān)重要，Nsp1β可抑制IRF3的磷酸化與核易位，從而抑制I型IFN產(chǎn)生。Nsp1可強(qiáng)烈抑制IFN-B啟動(dòng)子激活，并通過核內(nèi)降解cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）的結(jié)合蛋白（CBP），從而破壞IFN基因表達(dá)關(guān)鍵增強(qiáng)子的形成。Nsp2含有與OUT結(jié)構(gòu)域相關(guān)的早期解離活性位點(diǎn)和CP活性位點(diǎn)，早期解離活性在ISGs和NF–κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用，CP活性位點(diǎn)抑制IRF3磷酸化與核轉(zhuǎn)運(yùn)，負(fù)調(diào)控I型IFN產(chǎn)生[4]。Nsp4可抑制IFN-β產(chǎn)生。Nsp11可阻斷IRF3和IκB磷酸化，導(dǎo)致IRF3和IκB的核轉(zhuǎn)運(yùn)受到抑制，從而抑制RIG-I信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，Nsp11通過NendoU結(jié)構(gòu)域降解IFN-β啟動(dòng)刺激因子（IPS-1）的mRNA，IPS-1的降解導(dǎo)致下游信號(hào)通路的抑制，從而阻礙IRF3和NF-κB下游的激活。

3 PRRSV對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控

3.1 N蛋白正調(diào)控NF-κB通路 病毒根據(jù)自身需要來激活或抑制NF-κB通路，因而許多病毒已經(jīng)進(jìn)化以阻斷NF-κB激活來逃避宿主先天性免疫。用傳染性胃腸炎病毒刺激豬漿細(xì)胞樣DC（plasmacytoid dendritic cells，pDCs），PRRSV 促 進(jìn)NF-κB磷酸化；而且PRRSV感染Marc-145細(xì)胞和PAMs晚期激活了NF-κB通路。病毒激活NF-κB通路，調(diào)控宿主細(xì)胞的增殖和凋亡，以利于病毒增殖；然而通過超量表達(dá)IκBα顯性失活形式來阻止NF-κB的激活并未影響病毒增殖，表明PRRSV激活NF-κB通路可能參與細(xì)胞凋亡或調(diào)控細(xì)胞因子等其他過程[5]。

N蛋白的30-73位氨基酸區(qū)域參與NF-κB激活，核定位信號(hào)與核仁定位信號(hào)都位于這個(gè)活性區(qū)域，因而推測(cè)NF-κB的激活與N蛋白的核定位有關(guān)，這個(gè)區(qū)域?qū)τ贜端二聚化非常重要，二聚化蛋白可以嵌入到NF-κB激活區(qū)域，暗示二聚化可能與NF-κB激活有關(guān)[3]。

3.2 Nsp1α 和Nsp2負(fù)調(diào)控NF-κB通路 Nsp1α可抑制NF-κB激活，利用NF-κB和PRDII熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，檢測(cè)Nsp1α在轉(zhuǎn)染24 h后兩種熒光素活性的降低情況。當(dāng)有Nsp1α存在時(shí)，IκBα磷酸化受到抑制，導(dǎo)致刺激TNF-α的NF-κB核轉(zhuǎn)位阻斷，基因突變表明Nsp1αN端鋅指結(jié)構(gòu)基序（ZF1）對(duì)于Nsp1α抑制IFN產(chǎn)生至關(guān)重要。目前還不能確定Nsp1降解CBP是由Nsp1α還是Nsp1β介導(dǎo)的，推測(cè)細(xì)胞質(zhì)中的Nsp1激活NF-κB，細(xì)胞核中的Nsp1通過鋅指結(jié)構(gòu)基序降解CBP[6]。研究發(fā)現(xiàn)Nsp1α羧基端的第176位氨基酸能夠抑制IFN-β產(chǎn)生。

泛素化參與RIG-I和TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，如募集接頭蛋白及IκBα降解。Nsp2可通過OUT結(jié)構(gòu)域抑制I型IFN產(chǎn)生，OUT結(jié)構(gòu)域能夠使泛素和ISG15與底物解離，而且Nsp2可通過未知機(jī)制負(fù)調(diào)控NF-κB激活，此外Nsp2可能干預(yù)磷酸化的IκB聚泛素化，導(dǎo)致IκB降解失活[7]。

4 PRRSV抑制JAK-STAT信號(hào)通路與ISG表達(dá)

PRRSV感染Marc-145細(xì)胞24 h后，抑制JAK-STAT通路，阻斷ISGF3核轉(zhuǎn)運(yùn)。傳染性胃腸炎病毒刺激pDCs，STAT1的核轉(zhuǎn)運(yùn)被PRRSV抑制，在此過程N(yùn)sp1β通過抑制STAT1磷酸化和IS?GF3核轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)揮重要作用；酵母雙雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Nsp1α與PIAS1相互作用，PIAS1作為STAT1通路的負(fù)調(diào)控子和SUMO E3連接酶發(fā)揮作用；Nsp1α與PIAS1作用導(dǎo)致Nsp1α類泛素化，加速Nsp1α轉(zhuǎn)運(yùn)入核[8]。Nsp2的OUT結(jié)構(gòu)域具有去泛素化活性，在293T細(xì)胞中可降低泛素化與ISG化，表明病毒可通過Nsp2的早期解離逃避先天性免疫。綜上所述，在PRRSV感染早期，Nsp1、Nsp2和Nsp11加速病毒基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯，然而通過抑制I型IFN產(chǎn)生和誘導(dǎo)IFN的信號(hào)通路，來抑制感染細(xì)胞的免疫反應(yīng)。在感染后36～48 h，當(dāng)感染進(jìn)入晚期時(shí)，NF-kB通路被激活，有助于病毒在宿主體內(nèi)的存活[9]。

5 PRRSV與細(xì)胞凋亡

豬感染后，PRRSV可導(dǎo)致感染細(xì)胞的鄰近細(xì)胞發(fā)生凋亡。GP5蛋白通過其N末端119個(gè)氨基酸序列作用B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）的下游誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Nsp4是一個(gè)關(guān)鍵的凋亡誘導(dǎo)劑，依賴于絲氨酸蛋白酶活性誘導(dǎo)凋亡。PRRSV感染豬肺泡細(xì)胞和來源于單核細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞8 h，感染細(xì)胞趨于抗凋亡，但最終所有感染細(xì)胞由于凋亡和壞死全部死亡。病毒蛋白的表達(dá)對(duì)于誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗凋亡狀態(tài)非常必要，在感染的吞噬細(xì)胞內(nèi)未檢測(cè)到結(jié)構(gòu)蛋白以前，就檢測(cè)到由PRRSV介導(dǎo)的抗凋亡效應(yīng)，所以非結(jié)構(gòu)蛋白可能參與抑制凋亡[10]。病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和I型IFN的產(chǎn)生對(duì)于宿主抵抗侵入病毒的防御機(jī)制非常重要，因而PRRSV可能積極干擾細(xì)胞凋亡，部分原因可能病毒是抑制I型IFN的產(chǎn)生，尤其是在感染早期階段[11]。

IPS-1能夠誘導(dǎo)RIG-I信號(hào)通路，導(dǎo)致I型IFN表達(dá)及線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，研究表明，IPS-1作為I型IFN誘導(dǎo)與細(xì)胞凋亡的一個(gè)橋梁發(fā)揮作用。PRRSV的Nsp11與SARS-CoV的Nsp15同源，SARS-CoV的Nsp15是核糖核酸內(nèi)切酶，不依賴于IRF3的激活，抑制IPS-1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，暗示抑制IPS-1導(dǎo)致抑制細(xì)胞凋亡可能是PRRSV逃避免疫的一種方式[12]。

6 結(jié)語(yǔ)

PRRSV可操縱TLR、RIG-I及JAK-STAT信號(hào)通路調(diào)控IFN產(chǎn)生，此外PRRSV還可激活或抑制包括NF-κB通路在內(nèi)的其他通路；Nsp1、Nsp2和Nsp11等非結(jié)構(gòu)蛋白也參與I型IFN產(chǎn)生的調(diào)控，目前已經(jīng)鑒定出部分具有生物功能的結(jié)構(gòu)域和基序。由于對(duì)PRRSV如何逃避宿主免疫反應(yīng)的知識(shí)了解很少，導(dǎo)致對(duì)疾病控制不當(dāng)。因此深入開展抑制I型IFN機(jī)制研究，鑒定IFN調(diào)節(jié)的活性位點(diǎn)，應(yīng)用感染性cDNA構(gòu)建基因突變株，消除病毒的免疫抑制功能，構(gòu)建新型減毒疫苗株，可能是控制PRRS的可行方法。

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