細(xì)菌生物膜模型研究進(jìn)展

邱明星，熊?chē)?guó)兵

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院泌尿外科，四川 成都 610072)

醫(yī)用生物材料尤其導(dǎo)尿管相關(guān)尿路感染為全球性重大衛(wèi)生負(fù)擔(dān)，生物材料在體內(nèi)感染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于材料表面細(xì)菌生物膜的形成，細(xì)菌生物膜形成是細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的重要機(jī)制。細(xì)菌生物膜為依附于某載體表面的由胞外多聚物與基質(zhì)網(wǎng)包被的高度組織化、系統(tǒng)化的微生物膜性聚合物，對(duì)細(xì)菌生物膜及相關(guān)感染進(jìn)行研究首先依賴(lài)于實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒓把芯考夹g(shù)的發(fā)展，這些技術(shù)經(jīng)過(guò)不斷發(fā)展，有些已經(jīng)十分成熟［1～7］。建立一個(gè)全面模擬生物膜感染發(fā)病過(guò)程的生物膜模型，必將對(duì)現(xiàn)有生物膜治療策略改進(jìn)及新治療技術(shù)的探索提供幫助。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛篌w可分為體外模型與體內(nèi)模型兩類(lèi)。體外模型(in vitro/ex vivo biofilm model)通常為人工生物膜裝置，是在不直接用動(dòng)物模型或感染宿主作為研究載體的情況下模擬微生物形成生物膜的外界條件，包括固體表面、特定的營(yíng)養(yǎng)、溫度等，來(lái)研究微生物形成生物膜能力、機(jī)制及其結(jié)構(gòu)等。體內(nèi)模型(in vivo biofilm model)所用的技術(shù)是體外生物膜研究技術(shù)的延伸，主要研究生物膜與感染宿主之間的相互作用包括生物膜附著于宿主內(nèi)部或表面，包括牙齒、器官組織、人工置入導(dǎo)管等的生長(zhǎng)情況，生物膜在感染宿主體內(nèi)被免疫系統(tǒng)及抗生素治療后的清楚情況以及生物膜對(duì)感染宿主的影響等，是研究開(kāi)發(fā)生物膜感染新治療方法的關(guān)鍵技術(shù)?，F(xiàn)通過(guò)復(fù)習(xí)文獻(xiàn)，對(duì)細(xì)菌生物膜模型研究進(jìn)展進(jìn)行概述如下。

1 體外細(xì)菌生物膜模型

常見(jiàn)體外人工生物膜發(fā)生裝置有很多，簡(jiǎn)單地在瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落即為生物膜，而復(fù)雜的模型則有多種可控條件，可根據(jù)培養(yǎng)的方法將體外模型分為密閉或靜態(tài)模型(closed or static models)與開(kāi)放或動(dòng)態(tài)模型(open or dynamic systems)及小型實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(microcosms)3類(lèi)。

1.1 體外靜態(tài)細(xì)菌生物膜模型

1.1.1 菌落法 菌落(bacterial colony/biofilm)在某種程度上也可以稱(chēng)為生物膜，即菌落生物膜。將菌液稀釋至一定程度，涂布于固體培養(yǎng)基，待長(zhǎng)出成片的菌落即可，簡(jiǎn)單可重復(fù)，可用于高通量檢測(cè)，該方法多應(yīng)用于生物膜的通透性研究。Corcuera MT等［8］采用菌落法建立金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、大腸桿菌生物膜模型，采用0.5%亞甲藍(lán)染色結(jié)合立體顯微鏡技術(shù)進(jìn)行定性與定量細(xì)菌瓊脂穿透實(shí)驗(yàn)。Zupan等應(yīng)用相同方法建立釀酒酵母菌及白色念珠菌生物膜模型，進(jìn)行定量瓊脂穿透實(shí)驗(yàn)［9］。新近，Gómez-Aguado 等［10］則采用菌落法建立枯草芽孢桿菌菌落生物膜，應(yīng)用組織化學(xué)染色結(jié)合光學(xué)與電子顯微鏡分層分析生物膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

1.1.2 試管法(test-tube method/tube reactor) 試管法是將細(xì)菌稀釋至適當(dāng)濃度裝入小試管容器，于適當(dāng)?shù)臏囟认蚂o置培養(yǎng)，則該細(xì)菌的生物膜將會(huì)在試管壁上形成。根據(jù)菌種厭氧好氧的不同，生物膜分別傾向形成于試管的底部或者氣液交界面。如R zicka等［11］采用克里斯坦森試管法在體外成功建立表皮葡萄球菌生物膜模型。Wagner等［12］采用透明有機(jī)玻璃試管(內(nèi)徑10 mm、外徑12 nm、長(zhǎng)20 cm，對(duì)內(nèi)表面打磨粗糙處理)作為成膜載體，經(jīng)CLSM與磁共振顯微鏡(MRM)證實(shí)體外成功建立細(xì)菌生物膜模型。Singhai等［13］采用試管法結(jié)合掃描電鏡成功建立產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶革蘭氏陰性菌生物膜模型。該方法簡(jiǎn)便、靈活、快捷，至今仍在生物膜研究中發(fā)揮作用。

1.1.3 置片法(slide method) 置片法即在細(xì)菌培養(yǎng)液中加入蓋玻片或其他片狀、管狀物靜置共培養(yǎng)，以提供額外的可供生物膜附著并可移動(dòng)處理的表面。Ahmed等［14］采用蓋玻片(glass slides)為載體體外成功建立腸毒素大腸桿菌生物膜模型，結(jié)果獲得實(shí)時(shí)定量 PCR技術(shù)驗(yàn)證。Domínguez-Manzano等［15］應(yīng)用掃描電鏡技術(shù)證實(shí)戊糖乳桿菌LPCO10或128/2株可在蓋玻片表面形成生物膜。由于加入玻片較大，可以直觀(guān)地比較BF的生長(zhǎng)狀況，甚至可以將其上生物膜刮下進(jìn)行研究。另外，還可將有生物膜附著的小管植入小鼠體內(nèi)，觀(guān)察生物膜相關(guān)的細(xì)菌感染狀況。

1.1.4 微孔板法(microtitre plate method) 相對(duì)于上述各種方法，微孔板有著批處理、高通量的優(yōu)勢(shì)，尤其是在加快大批樣品的操作速度同時(shí)還能保持試驗(yàn)一致性的優(yōu)點(diǎn)，可用于分子遺傳學(xué)研究。在實(shí)際操作中，微孔板邊緣孔中液體易于揮發(fā)而導(dǎo)致孔的結(jié)果數(shù)值過(guò)高，可在邊緣孔中僅加水，或者在微孔板上蓋濕毛巾用以保濕。Abbanat等［16］以菌落或微孔板生物膜檢測(cè)法評(píng)估頭孢吡普體外對(duì)金黃色葡萄球菌最小生物膜清除濃度。Cora a-Hubér等［17］采用高通量平板法評(píng)估慶大霉素、萬(wàn)古霉素、利福平、磷霉素、克林霉素和利奈唑胺對(duì)金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物膜抑制效果。

1.1.5 生物膜環(huán)實(shí)驗(yàn)(biofilm ring test) 生物膜環(huán)實(shí)驗(yàn)是將磁性微球固定于培養(yǎng)系統(tǒng)中，生物膜生成于其上，適于快速檢測(cè)生物膜形成，評(píng)估早期生物膜粘附事件，無(wú)需洗脫及染色過(guò)程，結(jié)果可行自動(dòng)化圖像分析。Chavant等［18］采用該法快速評(píng)估單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和木糖葡萄球菌形成細(xì)菌生物膜能力。

1.1.6 卡爾加里生物膜設(shè)備 加拿大卡爾加里大學(xué)生物膜研究小組研發(fā)了一種上蓋帶有小柱的微孔板，已經(jīng)商品化，可方便地處理或洗滌生長(zhǎng)在小柱上的細(xì)菌生物膜，稱(chēng)為卡爾加里生物膜裝置(CBD)［19］或直接稱(chēng)其為MBEC，每個(gè)小柱可逐個(gè)取出而不需開(kāi)放系統(tǒng)從而避免污染，尤其適于考察生物膜相對(duì)于其游離狀態(tài)菌體的耐藥性變化及尋找可以恢復(fù)生物膜對(duì)抗生素的敏感性藥物。Ali等［20］采用該模型評(píng)估新藥的抗菌性能，由于該商業(yè)設(shè)備價(jià)格不菲，已有學(xué)者對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，更加簡(jiǎn)單且便宜［21］。

1.2 體外動(dòng)態(tài)細(xì)菌生物膜模型

1.2.1 管路法 首先將適當(dāng)密度菌液注射入硅膠或其他材質(zhì)管路(channel)中靜置約1小時(shí)，使菌體貼附管壁，然后開(kāi)啟蠕動(dòng)泵，使液體培養(yǎng)基以一定速度在管路中流動(dòng)。流動(dòng)的培養(yǎng)基使生物膜在生長(zhǎng)過(guò)程中隨時(shí)處在一種剪切力的作用下，而這種力對(duì)生物膜的發(fā)生、發(fā)育都起著相當(dāng)重要的作用，并且該模型更加貼近水管或醫(yī)用導(dǎo)管相關(guān)生物膜的形成。Bagge等［22］采用硅膠管(內(nèi)徑6 mm)為成膜載體，以蠕動(dòng)泵控制勻速泵入培養(yǎng)液，建立銅綠假單胞菌生物膜，探討其暴露于亞胺培南發(fā)生基因表達(dá)與β-內(nèi)酰胺酶和海藻鹽的變化。

1.2.2 流室法(flow cells/flow chambers) 流室法與管路法原理基本一樣，唯一的不同在于生物膜附著的表面變成管路中嵌入的玻璃片，通過(guò)該平壁透明玻片，研究者可以實(shí)時(shí)觀(guān)測(cè)生物膜的生長(zhǎng)狀況，且不用損傷生物膜，這就是所謂的“在線(xiàn)觀(guān)察”甚至實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞觀(guān)察，但該模型價(jià)格昂貴且需專(zhuān)門(mén)技能操作，可實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)自動(dòng)化圖像分析［23］。由于在生物膜結(jié)構(gòu)觀(guān)察方面的獨(dú)到之處，流室法幾乎成為目前在生物膜研究領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的生物膜發(fā)生裝置。An等［24］描述了一種開(kāi)放式流室模型建立生物膜模型，以研究其在生物材料表面粘附并形成生物膜的特征。

1.2.3 滴流生物膜反應(yīng)器(drip flow biofilm reactor，DFR)DFR用于研究低速剪切力條件下生物膜形成情形，由四個(gè)平行的測(cè)試通道構(gòu)成，每個(gè)通道可容納一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的玻璃顯微鏡片大小或一個(gè)導(dǎo)管或限量的試樣，實(shí)驗(yàn)參數(shù)主要為低流速與高空氣交換率，生物膜可以一個(gè)傾斜的方式生長(zhǎng)。該模型是理想的傳感器監(jiān)測(cè)裝置，適于一般生物膜研究、生物膜冰凍切片、高生物量標(biāo)本制作、醫(yī)用材料及留置醫(yī)療器械檢驗(yàn)評(píng)估，尤其可用于創(chuàng)口生物膜模型建立。Goeres等［25］采用該系統(tǒng)評(píng)估低流體剪切條件下銅綠假單胞菌生物膜在接近空氣液界面形成生物膜的周期。Kadouri研發(fā)的DFR［26］也是一種持續(xù)流速生物膜系統(tǒng)，系統(tǒng)中剪切力值設(shè)定為最低，培養(yǎng)液可持續(xù)更新，在這個(gè)系統(tǒng)中的浮游細(xì)胞不會(huì)發(fā)生快速流失而可能停留在好長(zhǎng)時(shí)間，細(xì)菌更加緊密地處于附著和浮游之間一個(gè)平衡狀態(tài)的生活方式，常作為靜態(tài)與標(biāo)準(zhǔn)流室系統(tǒng)之間的方案。

1.2.4 旋碟法(rotating disk/disc reactors) 旋碟法不同于以上兩種方法，它是利用攪拌子攪動(dòng)培養(yǎng)基，使其處于渦旋狀態(tài)而提供剪切力，生物膜載體是由不同材料構(gòu)成的多個(gè)圓形小碟，鑲嵌于該容器的底部或者側(cè)壁上，生物膜形成后可以取下觀(guān)察處理，可研究多細(xì)菌生物膜標(biāo)本。Schwartz等研究［27］采用該法建立生物膜模型，實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)殺菌劑的療效、生物膜祛除能力及防污材料性能。Cotter等［28］對(duì)該模型進(jìn)行改良以評(píng)估嚴(yán)格定義溶解氧、流體剪切培養(yǎng)條件下表皮葡萄球菌生物膜形成以及該改良模型是否適于檢測(cè)生物膜樣品中的呼吸活性分層情況。

1.2.5 美國(guó)疾控中心生物膜反應(yīng)器(CDC Biofilm reactors) 該生物膜反應(yīng)器由8個(gè)聚丙烯容室構(gòu)成，分別含有懸于培養(yǎng)液包裹的3個(gè)試樣(生物膜生長(zhǎng)表面)供細(xì)菌粘附，系統(tǒng)剪切力條件設(shè)為中高值，培養(yǎng)液持續(xù)更新，可于不同時(shí)間點(diǎn)取樣，結(jié)果可靠且可商業(yè)獲得模型［29］。Gilmore 等［30］采用 CDC生物膜系統(tǒng)評(píng)估泌尿系材料表面尿垢生物膜的形成。Williams等［31］觀(guān)察了表皮葡萄球菌 ATCC 35984在CDC生物膜反應(yīng)器形成生物膜尤其胞外基質(zhì)的形成過(guò)程。

1.2.6 微型發(fā)酵罐 恒化器(chemostat)以恒定的速度流出培養(yǎng)液，使微生物生長(zhǎng)繁殖始終低于最快生長(zhǎng)速度，為一種微生物連續(xù)培養(yǎng)器，這種容器反映的是培養(yǎng)基的化學(xué)環(huán)境恒定。微型發(fā)酵罐(microfermentors)以恒化器為基礎(chǔ)，生物膜在由不同的材料構(gòu)成的一個(gè)可移動(dòng)的“刮鏟”(spatula)上形成，可設(shè)置不同流速的剪切力條件，通過(guò)將人體細(xì)胞覆蓋于刮鏟而易于轉(zhuǎn)換成體外小型實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，可進(jìn)行顯微、遺傳及生化分析，并評(píng)估抗生素療效及細(xì)菌生物膜形成能力。Tormo等［32］采用該模型建立表皮葡萄球菌生物膜進(jìn)行基因表達(dá)分析。

1.2.7 改良羅賓斯裝置(Modified Robbins Device，MRD)MRD為一種完全混合式循環(huán)反應(yīng)器，其中各個(gè)接口(port)沿矩形通道呈線(xiàn)性陣列，每個(gè)接口可插入“插頭”(plug)，該成膜載體插頭可方便拆卸并無(wú)菌更換，尤其適于模仿喉嚨條件和評(píng)價(jià)橡膠-氣管-食管假體不同產(chǎn)品的效果［33］。Linton 等［34］采用該模型直接比較表皮葡萄球菌RP62A在硅化玻璃、等離子體條件的玻璃、鈦、不銹鋼和聚四氟乙烯不同材料表面的粘附能力差異。

1.2.8 微流控芯片技術(shù)(microfluidic biochips) 微流控芯片技術(shù)為一種非侵入性技術(shù)，生物芯片嵌入在溫度控制的鋁塊中，具有非接觸的介電傳感器，用于監(jiān)視生物膜亞細(xì)胞組分介質(zhì)的變化，可敏感地檢測(cè)生物膜生長(zhǎng)和形成，適于研究細(xì)胞群動(dòng)態(tài)變化和定量分析細(xì)胞。Richter等［35］采用該技術(shù)監(jiān)測(cè)真菌生物膜的動(dòng)態(tài)變化。Gottschamel等［36］則應(yīng)用該技術(shù)測(cè)量單細(xì)胞多參數(shù)。

1.2.9 恒定深度膜發(fā)酵罐(constant depth film fer-menter) 生物膜在對(duì)聚四氟乙烯(PTFE)插頭上形成，生物膜的生長(zhǎng)和深度有限，多余生物膜將被去除以模擬機(jī)械生物膜去除如舌效應(yīng)或牙刷作用結(jié)果，尤其適于研究口腔生物膜［37］，檢測(cè)載體表面特性對(duì)生物膜形成的影響及細(xì)菌耐藥性［38，39］。

1.2.10 BioFlux裝置 一種高通量篩選流動(dòng)生物膜裝置，包括96個(gè)獨(dú)立的微流通道，以氣動(dòng)泵供應(yīng)培養(yǎng)液，每個(gè)通道剪切力可實(shí)現(xiàn)單獨(dú)控制，具有試劑及培養(yǎng)液成本低、高通量篩選、環(huán)境條件精確可控，能研究細(xì)胞群中單細(xì)胞各參數(shù)［40］。

1.2.11 環(huán)形反應(yīng)器(annular reactors) 環(huán)形反應(yīng)器主要包括兩個(gè)同心圓筒而構(gòu)建，外層靜態(tài)圓筒作為容器壁而內(nèi)層為旋轉(zhuǎn)圓筒，剪切力可控，檢測(cè)試樣可移除，用于評(píng)估抗感染藥物有效性，研究剪切力對(duì)生物膜的影響，尤其適于研究水生生物膜(aquatic biofilms)［41］。Paule 等［42］進(jìn)行改良了一種 Taylor-Couette型流量條件的光合環(huán)形旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器(RAB)用于成功建立光合細(xì)菌生物膜。

1.2.12 Sorbarod裝置 Sorbarod過(guò)濾塞作為生物膜生長(zhǎng)載體與培養(yǎng)液灌注的纖維素基質(zhì)相連，從而構(gòu)建了偽穩(wěn)定狀態(tài)，設(shè)置簡(jiǎn)單、可獲得大量生物膜、生長(zhǎng)速度可控、可獲得分散細(xì)胞標(biāo)本，適于評(píng)估抗生素的長(zhǎng)期效果。Hodgson等［43］應(yīng)用該模型成功建立了生長(zhǎng)速度可控的金黃色葡萄球菌生物膜模型用于生化分析。

1.2.13 灌注(膜)生物發(fā)酵罐 通過(guò)壓力灌注醋酸纖維素膜收集細(xì)菌標(biāo)本，過(guò)濾器系改良發(fā)酵罐的基底部，過(guò)濾器充滿(mǎn)新鮮培養(yǎng)基，新形成的和松散附著的細(xì)胞被用過(guò)的介質(zhì)過(guò)濾而出，該模型允許增長(zhǎng)-率速率可控，粘附的細(xì)菌量恒定并與限定的營(yíng)養(yǎng)濃度成比例，適于評(píng)抗細(xì)菌及殺真菌效果［44］。

1.3 體外小型實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)

1.3.1 概述 體外小型實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)為更復(fù)雜的模型，包括更多環(huán)境參數(shù)并考慮自然環(huán)境的復(fù)雜性和異質(zhì)性，旨在模擬原位情況或現(xiàn)場(chǎng)條件(in situ conditions)，通常包括數(shù)種細(xì)菌標(biāo)本并采用所研究環(huán)境中的材料，例如，應(yīng)用羥基磷灰石和唾液模擬口腔生物膜［45］，或采用人類(lèi)細(xì)胞覆蓋非生物表面以模仿體內(nèi)情況［46］。理論上，上述兩類(lèi)開(kāi)放或密閉模型系統(tǒng)均可轉(zhuǎn)為體外小型實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。

1.3.2 重組人上皮細(xì)胞(reconstituted human epithelia)模型 重組人上皮細(xì)胞模型中，細(xì)菌生物膜形成于口腔黏膜角質(zhì)形成細(xì)胞頂部，考慮到了一些宿主因素，如受體特異性、人類(lèi)細(xì)胞-細(xì)菌生物膜相互作用，常用于口腔生物膜研究［47］。

1.3.3 Zürich 生物膜模型(Zürich oral biofilm-model)Zürich口腔生物膜模型中，細(xì)菌生物膜形成于設(shè)置在24孔板中羥基磷灰石，為半高通量，可研究細(xì)菌群體動(dòng)態(tài)變化及其相同時(shí)點(diǎn)的細(xì)菌耐藥性，用于研究口腔生物膜［48］。Zürich燒傷生物膜模型(Zürich burn biofilm-model)中，復(fù)合微生物生物膜可形成于Dermaplast紗布片上，載體由24孔微量滴定板中一種蛋白膜被覆，研究多細(xì)菌微生物生物膜結(jié)構(gòu)，具有高重復(fù)性，模仿燒傷生物膜形成，適用于評(píng)估藥物抗菌效率［49］。

1.3.4 內(nèi)皮細(xì)胞流動(dòng)模型 內(nèi)皮細(xì)胞流動(dòng)模型中，生物膜形成于附著在顯微鏡載玻片、持續(xù)培養(yǎng)基灌注的人血管內(nèi)皮細(xì)胞，具有連續(xù)流動(dòng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給，實(shí)時(shí)倒置熒光顯微鏡觀(guān)察成像，可評(píng)估剪切力對(duì)血管的影響，適于評(píng)估生物膜形成及其對(duì)血管與瓣膜的動(dòng)態(tài)影響［50］。

1.3.5 氣道上皮細(xì)胞模型 氣道上皮細(xì)胞置于膠原蛋白涂覆的膜上，從而在氣-液交界面形成生物膜，模擬慢性鼻-鼻竇炎、囊性纖維化和其他生物膜相關(guān)的肺部感染［51］。

1.3.6 微流控芯片共培養(yǎng)模型 微流體通道被HeLa細(xì)胞被覆，而生物膜在該被覆通道形成，可分析宿主-細(xì)菌交互作用，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生物膜形成過(guò)程，用于模擬細(xì)菌胃腸道定植，分析人類(lèi)細(xì)胞-細(xì)菌生物膜的相互作用［52］。

1.4 體外生物膜模型

1.4.1 概述 在體外(in vitro)和體內(nèi)(in vivo)之間的體外模型(ex vivo models)，該類(lèi)模型中，機(jī)體(通常為豬或鼠)中提取出組織或器官，放置于人工環(huán)境進(jìn)行進(jìn)一步的分析和試驗(yàn)。經(jīng)常被忽視的是，該類(lèi)模型較體內(nèi)模型允許存在更多的實(shí)驗(yàn)控制條件，可以為活的實(shí)驗(yàn)對(duì)象提供另一種替代以符合倫理標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)驗(yàn)，尤其適于成像或分析細(xì)菌在既定器官或組織上的定植，如氣管上皮、陰道黏膜、腎臟或牙齒［53～56］，還可用于評(píng)估生物膜感染有效治療的不同時(shí)間窗［57］。

1.4.2 根管生物膜 提取的牙齒嵌入在硅膩?zhàn)硬⒂枰怨嘧?，同時(shí)灌注牙齒表面，該技術(shù)可允許成像，適于研究牙科生物膜及感染根管治療［58］。

1.4.3 心臟瓣膜的體外模型 利用離體豬心臟瓣膜，研究細(xì)菌和瓣膜組織的初始相互作用，可改良后用于成像(場(chǎng)發(fā)射掃描顯微鏡)，適于探討進(jìn)展性心內(nèi)膜炎［59］。

1.4.4 陰道黏膜念珠菌病 兔陰道放置在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，采用顯微方法評(píng)價(jià)最優(yōu)(激光共聚焦掃描)，常用于念珠菌生物膜模型研究［60］。

1.4.5 RWV反應(yīng)器 能夠生長(zhǎng)的三維生物膜結(jié)構(gòu)體系，無(wú)泡曝氣、維持細(xì)胞的極性、分化和產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，規(guī)避傳統(tǒng)單層的局限性，最大限度地減少細(xì)胞機(jī)械損傷并保持微重力條件，已被用于肺銅綠假單胞菌感染［61］、腸沙門(mén)氏菌［62］和致腎盂腎炎大腸桿菌模型［63］研究。

體外生物膜發(fā)生裝置是生物膜研究的首要工具，根據(jù)研究目的的不同而選擇一個(gè)恰當(dāng)?shù)哪Ｐ蛯?duì)試驗(yàn)的順利開(kāi)展至關(guān)重要。就同一個(gè)模型來(lái)說(shuō)，實(shí)際應(yīng)用當(dāng)中仍有許多關(guān)鍵參數(shù)需要關(guān)注或調(diào)整，比如選用的菌種、培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、流速大小、生物膜形成表面的材料性質(zhì)等。由于體外模型僅提供簡(jiǎn)單的環(huán)境條件，應(yīng)當(dāng)采取恰當(dāng)?shù)捏w內(nèi)模型進(jìn)一步驗(yàn)證體外模型研究結(jié)果，從而為而后轉(zhuǎn)化為更高級(jí)生物體或臨床應(yīng)用創(chuàng)造條件。

2 體內(nèi)細(xì)菌生物膜模型

2.1 概述 過(guò)去數(shù)十年中，為了克服應(yīng)用哺乳動(dòng)物模型的實(shí)際困難，通常選擇非哺乳動(dòng)物模型用于研究目的，如果蠅或斑馬魚(yú)，其適于研究宿主-微生物相互作用及免疫系統(tǒng)反應(yīng)，尤其與生物膜定植于腸道相關(guān)的研究［64］。隨著研究的深入，大量動(dòng)物模型開(kāi)始應(yīng)用于研究，包括小鼠、兔、貓、豬及猴等。依據(jù)動(dòng)物類(lèi)型大體分為非哺乳動(dòng)物模型(non-mammalian models)與哺乳動(dòng)物模型(mammalian models)兩大類(lèi)，后者又可分為組織相關(guān)生物膜模型(tissue-associated biofilm models)與植入物相關(guān)感染模型(in vivo models of device-related infections)，其中組織相關(guān)生物膜模型包括肺感染、泌尿道感染、消化道感染、創(chuàng)口感染、感染性心內(nèi)膜炎、耳鼻喉感染、口腔感染及其他生物膜相關(guān)感染模型，簡(jiǎn)要回顧如下。

2.2 非哺乳動(dòng)物模型 Benghezal等［65］基于四膜蟲(chóng)和肺炎克雷伯菌細(xì)胞的相互作用，設(shè)計(jì)了一個(gè)簡(jiǎn)單的替代宿主模型(四膜蟲(chóng)生物膜模型)用于檢測(cè)毒力及發(fā)現(xiàn)抗毒性分子，篩選出小分子庫(kù)并鑒定了數(shù)個(gè)毒力抑制劑，進(jìn)而在小鼠肺炎模型中證實(shí)抗毒力分子通過(guò)減少在肺部的細(xì)菌負(fù)荷發(fā)揮肺炎克雷伯氏菌和銅綠假單胞菌的抗菌活性。Sandstr?m等［66］則建立棘阿米巴生物膜模型，研究宿主與細(xì)菌相互作用并輔助研發(fā)新藥。Kounatidis等［67］利用果蠅模型研究先天免疫系統(tǒng)對(duì)感染的防御作用。Kanther等［68］以斑馬魚(yú)模型進(jìn)行體內(nèi)成像及遺傳學(xué)分析，探討宿主-細(xì)菌相互作用。

2.3 哺乳動(dòng)物模型

2.3.1 組織相關(guān)生物膜模型 ①肺感染模型:囊性纖維化(cysticfibrosis)肺部感染為臨床診治難點(diǎn)，相關(guān)生物膜模型包括瓊脂珠為基礎(chǔ)的感染模型(agarbead based infection model，大鼠、小鼠、貓、豚鼠和猴子)、海藻藻酸鹽微球感染(seaweed alginate microsphere infection，大鼠、小鼠、豚鼠)、瓊脂珠為基礎(chǔ)的模型(agar-bead based model，豬)及CF模型(CFTR基因-/-小鼠，豬、小鼠、雪貂)四類(lèi)。如 Cash等［69］以采用氣管內(nèi)接種的沉浸在瓊脂細(xì)菌，通過(guò)組織學(xué)檢測(cè)證實(shí)成功建立了銅綠假單胞菌慢性呼吸道感染大鼠模型。Clarke等［70］通過(guò)基因敲除技術(shù)靶向剔除小鼠CFTR基因(CFTR-/-)建立囊性纖維化模型，進(jìn)一步研究證實(shí)該模型小鼠氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)異常，從而預(yù)測(cè)人類(lèi)CF上皮細(xì)胞改變。②泌尿道感染模型:目前有小鼠膀胱炎模型及慢性膀胱炎的大鼠模型。如Ozok等［71］通過(guò)經(jīng)尿道膀胱灌注大腸桿菌，經(jīng)過(guò)尿液細(xì)菌計(jì)數(shù)及膀胱、前列腺組織切片檢測(cè)證實(shí)成功建立慢性膀胱炎大鼠模型。Blango等［72］則采用麻醉下經(jīng)尿道灌注細(xì)菌懸液，經(jīng)膀胱組織切片證實(shí)成功建立小鼠膀胱炎模型。③創(chuàng)口感染模型:包括針劃傷/皮膚擦傷耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染小鼠模型、傷口耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染小鼠模型、切除傷口金黃葡萄球菌感染小鼠模型、缺血?jiǎng)?chuàng)面葡萄球菌感染大鼠模型、皮膚傷口愈合葡萄球菌感染兔模型、皮膚傷口金黃葡萄球菌感染豬模型、糖尿病足傷口脆弱類(lèi)桿菌或產(chǎn)氣莢膜梭菌感染小鼠模型。如Mastropaolo等［73］采用皮下注射混合大腸桿菌、脆弱擬桿菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌菌懸液，以細(xì)菌計(jì)數(shù)、血象變化證實(shí)成功建立糖尿病足傷口感染小鼠模型。Nakagami等［74］采用皮內(nèi)、肌內(nèi)注射和局部接種銅綠假單胞菌菌懸液，經(jīng)組織學(xué)檢測(cè)證實(shí)成功建立缺血?jiǎng)?chuàng)面感染模型。④口腔感染模型:包括變形鏈球菌感染實(shí)驗(yàn)倉(cāng)鼠齲模型、變形鏈球菌感染囊性纖維化小鼠模型及牙齦卟啉單胞菌感染牙周病大鼠模型。如經(jīng)過(guò)洗脫期后，Bainbridge等［75］采用微生物菌懸液灌胃，經(jīng)PCR檢測(cè)口腔唾液標(biāo)本中細(xì)菌DNA證實(shí)牙齦卟啉單胞菌的定植，從而成功建立牙齦卟啉單胞菌感染牙周病大鼠模型。

2.3.2 植入物相關(guān)感染模型 ①血管導(dǎo)管生物膜感染模型:主要包括中心靜脈導(dǎo)管(CVC)白色念珠菌/金黃色葡萄球菌/表皮葡萄球菌感染小鼠或兔模型、完全植入式靜脈輸液港(TIVAP)金黃色葡萄球菌/表皮葡萄球菌/銅綠假單胞菌/大腸桿菌感染兔模型2大類(lèi)。如Chauhan等［76］采用兔背側(cè)中線(xiàn)植入TIVAP，繼而通過(guò)外置Huber接種菌懸液，采用生物發(fā)光信號(hào)結(jié)合圖像分析證實(shí)成功建立感染兔模型。②尿路導(dǎo)管生物膜感染模型:主要包括膀胱的玻璃珠大腸桿菌感染大鼠模型、膀胱(手術(shù))導(dǎo)管片銅綠假單胞菌/大腸桿菌感染小鼠或大鼠模型、膀胱(非手術(shù))導(dǎo)管片奇異變形桿菌/銅綠假單胞菌感染/大腸桿菌兔/鼠模型、外導(dǎo)尿管大腸桿菌兔模型。如Hachem等［77］通過(guò)尿道口接種鏈霉素耐藥大腸桿菌，通過(guò)對(duì)尿液、尿道組織切片及導(dǎo)管電鏡檢測(cè)證實(shí)成功建立大腸桿菌生物膜感染模型。③骨科植入物生物膜感染模型:涉及脛骨植入物(兔模型)、脛骨電極植入(兔模型)、骨和金屬螺釘(兔模型)、脊柱裝置植入(兔模型)、脛骨鈦絲/不銹鋼針植入、脛骨骨水泥、股管圓柱形裝置植入(狗模型)、髓內(nèi)釘(狗模型)、骨折固定不銹鋼板(羊模型)相關(guān)感染模型。如Williams等［78］采用體外耐甲氧西林金黃色葡萄球菌在CDC反應(yīng)器成膜，繼而將其放置在并置的羊脛骨近端內(nèi)側(cè)，在赤裸的皮質(zhì)表面剝離骨膜，并隨后由一個(gè)模擬的骨折固定板，經(jīng)過(guò)熒光染色及組織切片證實(shí)成功建立生物膜植入相關(guān)的骨髓炎羊模型。

2.4 體內(nèi)生物膜相關(guān)感染模型的陷阱 針對(duì)每類(lèi)感染性疾病已經(jīng)研發(fā)了大量體內(nèi)模型用于探討細(xì)菌粘附、評(píng)估不同材料表面結(jié)構(gòu)、開(kāi)發(fā)預(yù)防或治療策略，正如大量用于研究CVC相關(guān)感染體內(nèi)模型一樣［79］。因此，沒(méi)有關(guān)于某種模型就能回答具體問(wèn)題的金標(biāo)準(zhǔn)，這取決于宿主免疫系統(tǒng)、生物材料大小及表面結(jié)構(gòu)以及環(huán)境因素。這些模型為研究者提供各種各樣的選擇，然而，需要就使用相同的模型使研究標(biāo)準(zhǔn)化需要協(xié)調(diào)一致的努力(就動(dòng)物的品系、細(xì)菌接種的路徑及劑量等)，以此研究者方可采用相同的模型，進(jìn)而比較其研究結(jié)果。

綜上，針對(duì)不同類(lèi)型對(duì)細(xì)菌生物膜感染已經(jīng)研發(fā)出多種細(xì)菌生物膜感染模型，不同模型具有其優(yōu)缺點(diǎn)，可結(jié)合研究所需選擇相應(yīng)模型。然而，就完全模擬臨床感染現(xiàn)況而言，尚未有滿(mǎn)意的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。盡可能完全模擬體內(nèi)感染情況及動(dòng)物體內(nèi)細(xì)菌生物膜模型標(biāo)準(zhǔn)化將為今后細(xì)菌生物膜感染模型的研究重點(diǎn)。

［1］David Lebeaux，Ashwini Chauhan，Olaya Rendueles，et al.From in vitro to in vivo Models of Bacterial Biofilm-Related Infections［J］.Pathogens，2013，2:288-356.

［2］Merritt JH，Kadouri DE，O＇Toole GA.Growing and analyzing static biofilms［M］.Curr Protoc Microbiol:2005.

［3］Seth AK，Geringer MR，Hong SJ，et al.In vivo modeling of biofilminfected wounds:a review［J］.J Surg Res，2012，178(1):330-338.

［4］Monds RD，O＇Toole GA.The developmental model of microbial biofilms:ten years of a paradigm up for review［J］.Trends Microbiol，2009，17(2):73-87.

［5］McBain AJ.Chapter 4:In vitro biofilm models:an overview［J］.Adv Appl Microbiol，2009，69:99-132.

［6］Coenye T，Nelis HJ.In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation［J］.J Microbiol Methods，2010，83(2):89-105.

［7］Sissons CH.Artificial dental plaque biofilm model systems［J］.Adv Dent Res，1997，11(1):110-126.

［8］Corcuera MT，Gómez-Aguado F，Gómez-Lus ML，et al.Qualitative and quantitative agar invasion test based on bacterial colony/biofilm［J］.J Microbiol Methods，2013，94(3):267-273.

［9］Zupan J，Raspor P.Quantitative agar-invasion assay［J］.J Microbiol Methods，2008，73(2):100-104.

［10］Gómez-Aguado F，Corcuera MT，Gómez-Lus ML，et al.Histological approach to Bacillus subtilis colony-biofilm:evolving internal architecture and sporulation dynamics［J］.Histol Histopathol，2013，28(10):1351-1360.

［11］Rzicka F，Holá V，Votava M，et al.Biofilm detection and the clinical significance of Staphylococcus epidermidis isolates［J］.Folia Microbiol(Praha)，2004，49(5):596-600.

［12］Wagner M，Manz B，Volke F，et al.Online assessment of biofilm development，sloughing and forced detachment in tube reactor by means of magnetic resonance microscopy［J］.Biotechnol Bioeng，2010，107(1):172-181.

［13］Singhai M，Malik A，Shahid M，et al.A study on device-related infections with special reference to biofilm production and antibiotic resistance［J］.J Glob Infect Dis，2012，4(4):193-198.

［14］Ahmed D，Islam MS，Begum YA，et al.Presence of enterotoxigenic Escherichia coli in biofilms formed in water containers in poor households coincides with epidemic seasons in Dhaka［J］.J Appl Microbiol，2013，114(4):1223-1229.

［15］Domínguez-Manzano J，León-Romero á，Olmo-Ruiz C，et al.Biofilm formation on abiotic and biotic surfaces during Spanish style green table olive fermentation［J］.Int J Food Microbiol，2012，157(2):230-238.

［16］Abbanat D，Shang W，Amsler K，et al.Evaluation of the in vitro activities of ceftobiprole and comparators in staphylococcal colony or microtitre plate biofilm assays［J］.Int J Antimicrob Agents，2014，43(1):32-39.

［17］Cora?a-Hubér DC，F(xiàn)ille M，Hausdorfer J，et al.Evaluation of MBEC?-HTP biofilm model for studies of implant associated infections［J］.J Orthop Res，2012，30(7):1176-1180.

［18］Chavant P，Gaillard-Martinie B，Talon R，et al.A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria［J］.J Microbiol Methods，2007，68(3):605-612.

［19］Ceri H，Olson ME，Stremick C，et al.The Calgary Biofilm Device:new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms［J］.J Clin Microbiol，1999，37(6):1771-1776.

［20］Ali L，Khambaty F，Diachenko G.Investigating the suitability of the Calgary Biofilm Device for assessing the antimicrobial efficacy of new agents［J］.Bioresour Technol，2006，97(15):1887-1893.

［21］Almshawit H，Macreadie I，Grando D.A simple and inexpensive device for biofilm analysis［J］.J Microbiol Methods，2014，98:59-63.

［22］Bagge N，Schuster M，Hentzer M，et al.Pseudomonas aeruginosa biofilms exposed to imipenem exhibit changes in global gene expression and beta-lactamase and alginate production［J］.Antimicrob A-gents Chemother，2004，48(4):1175-1187.

［23］Heydorn A，Ersb?ll BK，Hentzer M，et al.Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms［J］.Microbiology，2000，146(Pt 10):2409-2415.

［24］An YH，McGlohorn JB，Bednarski BK，et al.An open channel flow chamber for characterizing biofilm formation on biomaterial surfaces［J］.MethodsEnzymol，2001，337:79-88.

［25］Goeres DM，Hamilton MA，Beck NA，et al.A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor［J］.Nat Protoc，2009，4(5):783-788.

［26］Merritt JH，Kadouri DE，O＇Toole GA.Growing and analyzing static biofilms［J］.Curr Protoc Microbiol，2005，Chapter 1:Unit 1B.1.

［27］Schwartz K，Stephenson R，Hernandez M，et al.The use of drip flow and rotating disk reactors for Staphylococcus aureus biofilm analysis［J］.J Vis Exp，2010，(46).pii:2470.

［28］Cotter JJ，O＇Gara JP，Stewart PS，et al.Characterization of a modified rotating disk reactor for the cultivation of Staphylococcus epidermidis biofilm［J］.J Appl Microbiol，2010，109(6):2105-2117.

［29］Goeres DM，Loetterle LR，Hamilton MA，et al.Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms［J］.Microbiology，2005，151(Pt 3):757-762.

［30］Gilmore BF，Hamill TM，Jones DS，et al.Validation of the CDC biofilm reactor as a dynamic model for assessment of encrustation formation on urological device materials［J］.J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2010，93(1):128-140.

［31］Williams DL，Bloebaum RD.Observing the biofilm matrix of Staphylococcus epidermidis ATCC 35984 grown using the CDC biofilm reactor［J］.Microsc Microanal，2010，16(2):143-152.

［32］Tormo MA，Martí M，Valle J，et al.SarA is an essential positive regulator of Staphylococcus epidermidis biofilm development［J］.J Bacteriol，2005，187(7):2348-2356.

［33］Millar MR，Linton CJ，Sherriff A.Use of a continuous culture system linked to a modified Robbins device or flow cell to study attachment of bacteria to surfaces［J］.MethodsEnzymol，2001，337:43-62.

［34］Linton CJ，Sherriff A，Millar MR.Use of a modified Robbins device to directly compare the adhesion of Staphylococcus epidermidis RP62A to surfaces［J］.J Appl Microbiol，1999，86(2):194-202.

［35］Richter L，Stepper C，Mak A，et al.Development of a microfluidic biochip for online monitoring of fungal biofilm dynamics［J］.Lab Chip，2007，7(12):1723-1731.

［36］Gottschamel J，Richter L，Mak A，et al.Development of a disposable microfluidic biochip for multiparameter cell population measurements［J］.Anal Chem，2009，81(20):8503-8512.

［37］Pratten J.Growing oral biofilms in a constant depth film fermentor(CDFF)［J］.Curr Protoc Microbiol，2007，1:1-5.

［38］Peters AC，Wimpenny JW.A constant-depth laboratory model film fermentor［J］.Biotechnol Bioeng，1988，32(3):263-270.

［39］Pratten J，Wilson M，Spratt DA.Characterization of in vitro oral bacterial biofilms by traditional and molecular methods［J］.Oral Microbiol Immunol，2003，18(1):45-49.

［40］Benoit MR，Conant CG，Ionescu-Zanetti C，et al.New device for high-throughput viability screening of flow biofilms［J］.Appl Environ Microbiol，2010，76(13):4136-4142.

［41］Lawrence JR，Swerhone GD，Neu TR.A simple rotating annular reactor for replicated biofilm studies［J］.J Microbiol Methods，2000，42(3):215-224.

［42］Paule A，Lauga B，Ten-Hage L，et al.A photosynthetic rotating annular bioreactor(Taylor-Couette type flow)for phototrophic biofilm cultures［J］.Water Res，2011，45(18):6107-6118.

［43］Hodgson AE，Nelson SM，Brown MR，et al.A simple in vitro model for growth control of bacterial biofilms［J］.J Appl Bacteriol，1995，79(1):87-93.

［44］Gilbert P，Allison DG，Evans DJ，et al.Growth rate control of adherent bacterial populations［J］.Appl Environ Microbiol，1989，55(5):1308-1311.

［45］Rudney JD，Chen R，Lenton P，et al.A reproducible oral microcosm biofilm model for testing dental materials［J］.J Appl Microbiol，2012，113(6):1540-1553.

［46］Berry RE，Klumpp DJ，Schaeffer AJ.Urothelial cultures support intracellular bacterial community formation by uropathogenic Escherichia coli［J］.Infect Immun，2009，77(7):2762-2772.

［47］Schaller M，Sch?fer W，Korting HC，et al.Differential expression of secreted aspartyl proteinases in a model of human oral candidosis and in patient samples from the oral cavity［J］.Mol Microbiol，1998，29(2):605-615.

［48］Guggenheim B，Giertsen E，Schüpbach P，et al.Validation of an in vitro biofilm model of supragingival plaque［J］.J Dent Res，2001，80(1):363-370.

［49］Guggenheim M，Thurnheer T，Gmür R，et al.Validation of the Zürich burn-biofilm model［J］.Burns，2011，37(7):1125-1133.

［50］Grubb SE，Murdoch C，Sudbery PE，et al.Adhesion of Candida albicans to endothelial cells under physiological conditions of flow［J］.Infect Immun，2009，77(9):3872-3878.

［51］Woodworth BA，Tamashiro E，Bhargave G，et al.An in vitro model of Pseudomonas aeruginosa biofilms on viable airway epithelial cell monolayers［J］.Am J Rhinol，2008，22(3):235-258.

［52］Kim J，Hegde M，Jayaraman A.Microfluidic co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating soluble signal-mediated interactions［J］.J Vis Exp，2010，(38).pii:1749.

［53］Harriott MM，Lilly EA，Rodriguez TE，et al.Candida albicans forms biofilms on the vaginal mucosa［J］.Microbiology，2010，156(Pt 12):3635-3644.

［54］Lenton P，Rudney J，Chen R，et al.Imaging in vivo secondary caries and ex vivo dental biofilms using cross-polarization optical coherence tomography［J］.Dent Mater，2012，28(7):792-800.

［55］Melican K，Sandoval RM，Kader A，et al.Uropathogenic Escherichia coli P and Type 1 fimbriae act in synergy in a living host to facilitate renal colonization leading to nephron obstruction［J］.PLoS Pathog，2011，7(2):e1001298.

［56］Simmons WL，Dybvig K.Mycoplasma biofilms ex vivo and in vivo［J］.FEMS Microbiol Lett，2009，295(1):77-81.

［57］Wolcott RD，Rumbaugh KP，James G，et al.Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time-dependent therapeutic window［J］.J Wound Care，2010，19(8):320-328.

［58］Huang TY，Gulabivala K，Ng YL.A bio-molecular film ex-vivo model to evaluate the influence of canal dimensions and irrigation variables on the efficacy of irrigation［J］.Int Endod J，2008，41(1):60-71.

［59］Chuang-Smith ON，Wells CL，Henry-Stanley MJ，et al.Acceleration of Enterococcus faecalis biofilm formation by aggregation substance expression in an ex vivo model of cardiac valve colonization［J］.PLoS One，2010，5(12):e15798.

［60］Harriott MM，Lilly EA，Rodriguez TE，et al.Candida albicans forms biofilms on the vaginal mucosa［J］.Microbiology，2010，156(Pt 12):3635-3644.

［61］Carterson AJ，H?ner zu Bentrup K，Ott CM，et al.A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates:alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis［J］.Infect Immun，2005，73(2):1129-1140.

［62］Nickerson CA，Goodwin TJ，Terlonge J，et al.Three-dimensional tissue assemblies:novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis［J］.Infect Immun，2001，69(11):7106-7120.

［63］Smith YC，Grande KK，Rasmussen SB，et al.Novel three-dimensional organoid model for evaluation of the interaction of uropathogenic Escherichia coli with terminally differentiated human urothelial cells［J］.Infect Immun，2006，74(1):750-757.

［64］Lemaitre B，Ausubel FM.Animal models for host-pathogen interactions［J］.Curr Opin Microbiol，2008，11(3):249-250.

［65］Benghezal M，Adam E，Lucas A，et al.Inhibitors of bacterial virulence identified in a surrogate host model［J］.Cell Microbiol，2007，9(5):1336-1342.

［66］Sandstr?m G，Saeed A，Abd H.Acanthamoeba-bacteria:a model to study host interaction with human pathogens［J］.Curr Drug Targets，2011，12(7):936-941.

［67］Kounatidis I，Ligoxygakis P.Drosophila as a model system to unravel the layers of innate immunity to infection［J］.Open Biol，2012，2(5):120075.

［68］Kanther M，Rawls JF.Host-microbe interactions in the developing zebrafish［J］.Curr Opin Immunol，2010，22(1):10-19.

［69］Cash HA，Woods DE，McCullough B，et al.A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa［J］.Am Rev Respir Dis，1979，119(3):453-459.

［70］Clarke LL，Grubb BR，Gabriel SE，et al.Defective epithelial chloride transport in a gene-targeted mouse model of cystic fibrosis［J］.Science，1992，257(5073):1125-1128.

［71］Ozok HU，Ekim O，Saltas H，et al.The preventive role of transurethral antibiotic delivery in a rat model［J］.Drug Des Devel Ther，2012，6:187-194.

［72］Blango MG，Mulvey MA.Persistence of uropathogenic Escherichia coli in the face of multiple antibiotics［J］.Antimicrob Agents Chemother，2010，54(5):1855-1863.

［73］Mastropaolo MD，Evans NP，Byrnes MK，et al.Synergy in polymicrobial infections in a mouse model of type 2 diabetes［J］.Infect Immun，2005，73(9):6055-6063.

［74］Nakagami G，Sanada H，Sugama J，et al.Detection of Pseudomonas aeruginosa quorum sensing signals in an infected ischemic wound:an experimental study in rats［J］.Wound Repair Regen，2008，16(1):30-36.

［75］Bainbridge B，Verma RK，Eastman C，et al.Role of Porphyromonas gingivalis phosphoserine phosphatase enzyme SerB in inflammation，immune response，and induction of alveolar bone resorption in rats［J］.Infect Immun，2010，78(11):4560-4569.

［76］Chauhan A，Lebeaux D，Decante B，et al.A rat model of central venous catheter to study establishment of long-term bacterial biofilm and related acute and chronic infections［J］.PLoS One，2012，7(5):e37281.

［77］Hachem R，Reitzel R，Borne A，et al.Novel antiseptic urinary catheters for prevention of urinary tract infections:correlation of in vivo and in vitro test results［J］.Antimicrob Agents Chemother，2009，53(12):5145-5149.

［78］Williams DL，Haymond BS，Woodbury KL，et al.Experimental model of biofilm implant-related osteomyelitis to test combination biomaterials using biofilms as initial inocula［J］.J Biomed Mater Res A，2012，100(7):1888-1900.

［79］Chauhan A，Lebeaux D，Decante B，et al.A rat model of central venous catheter to study establishment of long-term bacterial biofilm and related acute and chronic infections［J］.PLoS One，2012，7(5):37281.