黃勛娟，刁寧寧，張建國

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院上海200093)

黑曲霉(Aspergillus niger)是一種常見的曲霉屬真菌，廣泛分布在谷物、空氣、土壤等各種物品上，在生物技術(shù)發(fā)展過程中發(fā)揮了很大的作用，很多產(chǎn)品來自于絲狀真菌的初級和次級代謝產(chǎn)物［1］。黑曲霉可用來生產(chǎn)檸檬酸和很多酶類，例如市場上常見淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、葡萄糖酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、半乳糖苷酶、木聚糖酶［2］、柚苷酶、單寧酶、脂肪酶、植酸酶［3］、蛋白酶、果膠酶等。還可以根據(jù)培養(yǎng)基的不同而產(chǎn)生不同種酶的組合，如纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶。根據(jù)黑曲霉在產(chǎn)酸性蛋白時(shí)對氮源的需要量可分為兩大類:一類是需要低C/N，添加無機(jī)氮對產(chǎn)酶有利，這一類的有齋藤曲霉(Aspergillus saito)、宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)等;另一類要求較高的C/N，例如泡盛酒曲霉(Aspergillus awamori)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)，這一類酶活性較低。由于美國食品和藥物管理局(FDA)已經(jīng)認(rèn)定許多來自黑曲霉的產(chǎn)物是安全的［4］，所以黑曲霉被廣泛用于食品級產(chǎn)物的生產(chǎn)過程中。黑曲霉不僅被用于生產(chǎn)胞外酶和有機(jī)酸類物質(zhì)，還被用來降解廢水中的有機(jī)物質(zhì)，緩解里氏木霉培養(yǎng)過程中纖維二糖的積累而產(chǎn)生的產(chǎn)物反饋抑制。黑曲霉逐漸被改造成模式細(xì)胞來生產(chǎn)多種代謝物［5］。由于黑曲霉生產(chǎn)代謝產(chǎn)物與它的菌絲形態(tài)有關(guān)系，本文對黑曲霉菌絲球的形成機(jī)制、菌絲球與產(chǎn)物的關(guān)系，以及菌絲的應(yīng)用等研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。黑曲霉在液態(tài)培養(yǎng)基中可以形成分散的菌絲，也可以形成菌絲球。菌絲球的形成機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)，而且菌絲球具有沉降速度快、易于固液分離、應(yīng)用廣等優(yōu)點(diǎn)，逐漸受到研究者的重視。

1 黑曲霉菌絲球的形成機(jī)理

絲狀真菌在液態(tài)培養(yǎng)中有2種完全不同的形態(tài):一種是由菌絲緊密聚集而成菌絲球;另一種是菌絲均勻地分散在培養(yǎng)液中呈細(xì)絲狀［6］。高橋穰二通過顯微鏡觀察，將絲狀真菌的菌絲球形成機(jī)制分為2種類型:一類是多個(gè)孢子首先聚集、膨脹，再生長出菌絲，由菌絲聚集纏繞形成菌絲球，稱為凝聚型(coagulative);另一類由單個(gè)孢子首先萌發(fā)而生長出菌絲，然后聚集成菌絲球，稱為非凝聚型(non-coagulative)。非凝聚型孢子的接種量與菌絲球的個(gè)數(shù)接近。而凝聚型孢子的接種量與菌絲球的個(gè)數(shù)呈倍數(shù)關(guān)系［7］。比較典型的凝聚型絲狀真菌有構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉和擔(dān)子菌白腐菌［8］。非凝聚型絲狀真菌有米根霉。LIN等［9］用種群動態(tài)描述軟件PARSIVAL(Particle size evalution)擬合黑曲霉孢子凝聚的2個(gè)階段后確定了2個(gè)步驟的時(shí)間節(jié)點(diǎn)。孢子在0～8 h內(nèi)依靠相互碰撞聚集在一起形成孢子聚集體;孢子聚集體在8～16 h內(nèi)萌發(fā)，萌發(fā)形成的菌絲利用更多的表面積吸附?jīng)]有萌發(fā)的孢子，導(dǎo)致溶液中孢子顆粒濃度急劇下降。孢子聚集體萌發(fā)形成菌絲球的決定性因素是菌絲比生長速率、菌絲表面與顆粒濃度之比。

從微觀角度分析，真菌孢子的表面電荷是影響孢子聚集和菌絲球形成的重要因素。孢子之間有3種作用力:范德華力、雙電層力和空間力。Krull等［10］通過原子力顯微鏡觀察，以及計(jì)算pH和鹽濃度對黑曲霉孢子間黏附力的影響表明，黑曲霉孢子的等電點(diǎn)為pH 2左右。pH提高，黑曲霉孢子的絕對電動電勢增加。這與高pH下孢子聚集的數(shù)量降低的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致［11］。Andreas Wargenau 等［12］先在酸性條件下研究了黑曲霉孢子表面電荷的來源。黑曲霉孢子在很寬的pH范圍內(nèi)呈現(xiàn)陰性的遷移率說明黑曲霉孢子在很寬的pH值范圍內(nèi)處于負(fù)Zeta電位，這是由于孢子壁上具有較多的弱酸基團(tuán)(例如羧基)。采用堿液提取孢子壁的黑色素發(fā)現(xiàn)，孢子釋放的黑色素量與孢子聚集性能成反比。這可能是堿液破壞了孢子壁上的弱酸基團(tuán)，也可能由于釋放黑色素后的孢子壁弱酸基團(tuán)減少了。由于黑色素分子中含有羧基，所以很可能是由于堿液的作用減少了孢子壁上的黑色素而減少了孢子壁上的羧基［12］。而且黑曲霉孢子凝聚與培養(yǎng)基中的離子有關(guān)系［13］，這符合膠體科學(xué)中的雙電層模型。Wargenau等進(jìn)一步利用膠體科學(xué)中的Poisson-Boltzmann模型分析，發(fā)現(xiàn)表面電勢與pH呈線性關(guān)系［12］。黑色素是黑曲霉孢子細(xì)胞壁成分之一，它是高分子質(zhì)量疏水性色素，可以保護(hù)黑曲霉分生孢子［14］。

疏水蛋白也被認(rèn)為在菌絲球形成過程中發(fā)揮重要作用。它是由真菌分泌的分子質(zhì)量小，含有8個(gè)半胱氨酸殘基的兩親表面活性蛋白［15］。疏水蛋白在接近親水-疏水界面時(shí)，自動組裝成一種兩親水脂膜［16］，在氣生菌絲的增長和真菌黏附到固體支撐物過程中有重要作用。Scholtmeijer［17］根據(jù)疏水蛋白的溶解性將其分為2類。第1類只能溶解在三氟乙酸和甲酸中;第2類能溶解在乙醇或十二烷基硫酸鈉。疏水蛋白在孢子的非特異性吸附中有重要作用［18］。黑曲霉可能產(chǎn)生這兩類疏水蛋白［19］，在孢子-表層和孢子-孢子吸引力中扮演了重要的角色，尤其在液態(tài)培養(yǎng)中孢子聚集和生物膜形成中有促進(jìn)作用，但是目前具體機(jī)理還不清楚。疏水蛋白有助于孢子之間的凝聚［16］。

孢子聚集后形成菌絲球的階段受到養(yǎng)分運(yùn)輸、菌絲細(xì)胞壁的抗張強(qiáng)度，以及細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)菌絲元素的影響［10］。通常情況下，絲狀真菌以恒定比生長速率增長，直到底物發(fā)生限制。真菌菌絲球的宏觀生長通常用顆粒半徑描述。通常一個(gè)菌絲體的主干菌絲平均長度為100～400 mm，菌絲球的半徑為250～2 500 mm。

2 黑曲霉菌絲球形成的影響因素

2.1 營養(yǎng)成分

黑曲霉可以利用多種碳源，在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中48h會形成菌絲球［20］，利用甘露醇、葡萄糖和蔗糖時(shí)在28～72 h間菌絲球直徑增長迅速加快，直至192 h時(shí)菌絲球直徑開始下降。而黑曲霉在利用可溶性淀粉時(shí)生長較慢，菌絲球較小，說明甘露醇、葡萄糖和蔗糖容易被菌絲球利用，所以菌絲球的直徑基本呈現(xiàn)勻速增長的狀態(tài)，生長速度快。Enshay等［21］在攪拌式反應(yīng)器中以葡萄糖和戊糖作為培養(yǎng)基培養(yǎng)黑曲霉，可以形成直徑不超過400 μm的菌絲球。以NH4NO3和NH4Cl做為氮源形成的菌絲球的直徑也較大，干濕比變化較穩(wěn)定。Fe2+可致菌絲球數(shù)量較少且大小極不均勻。而Mg2+不僅能促進(jìn)菌絲球數(shù)量增多，且生成的菌絲球大小均勻、表面光滑。Mg2+在孢子聚合過程中能夠起到促進(jìn)作用。而Na+在菌絲球形成的過程中作用較小，這是因?yàn)镹a+與黑色素的吸附力遠(yuǎn)小于 Mg2+與黑色素的吸附力［22］。Haq等［23］對金屬離子與培養(yǎng)基成分的相互作用的研究表明，在低于2.0×10-5mol/L的Fe2+中添加MgSO4可以降低Fe2+對菌絲生長的促進(jìn)作用。Mg2+可以使黑曲霉形成松散的菌絲球(直徑為0.6 mm)，且有利于檸檬酸的產(chǎn)生。而且添加Mg2+的時(shí)機(jī)也是一個(gè)重要因素。在培養(yǎng)12 h或者18 h后添加Mg2+可以形成較大的菌絲球。添加Cu2+也有類似的效果［23］。另外，增加培養(yǎng)基中磷的含量可以提高菌絲球的直徑［24］。

2.2 pH

黑曲霉菌絲球的形成機(jī)理表明，pH值是影響孢子凝聚的決定性因素，且認(rèn)為與孢子具有pH依賴性的表面特性有關(guān)系。培養(yǎng)基pH也是影響黑曲霉生成各種蛋白的重要因素［8］。黑曲霉的形態(tài)隨pH值的改變而有明顯變化，在pH 2時(shí)比較難形成菌絲球，在pH 3～10之間都可形成菌絲球。pH 3～6之間形成的菌絲球生物量大，球徑較均勻，外表光滑、韌性好;pH 7～10的生物量少，菌絲球小，不均勻，韌性差;當(dāng)培養(yǎng)基初始 pH為4～6時(shí)，菌絲球質(zhì)量較好。不同pH值下，不僅黑曲霉產(chǎn)生的酶的種類不同，酶活力也不同。黑曲霉產(chǎn)生多種有機(jī)酸，如檸檬酸、葡萄糖酸、草酸等的量也取決于pH。例如pH＜3.5時(shí)有利于TCA循環(huán)，從而積累更多的檸檬酸，而在pH 4.5～8時(shí)產(chǎn)生葡萄糖酸，pH為6左右可產(chǎn)生果膠酶。

2.3 孢子濃度

孢子碰撞形成晶核的機(jī)率受到孢子濃度的影響。菌絲球的直徑與孢子濃度呈負(fù)相關(guān)［24］。黑曲霉形成菌絲球的孢子濃度應(yīng)小于108/L。當(dāng)接種量為103/L時(shí)，孢子碰撞的機(jī)率小，所以有些菌絲球可能未飽和晶核形成。當(dāng)接種量增大為104/L時(shí)形成晶核的機(jī)會也相應(yīng)增大。當(dāng)接種量高于105/L，每個(gè)晶核所含有的孢子數(shù)目都達(dá)到飽和，所以孢子數(shù)量的增加導(dǎo)致晶核數(shù)目增加，于是形成菌絲球的數(shù)目也增加。接種量過低會使菌種生長緩慢，發(fā)酵周期延長，降低發(fā)酵效率，而過高的接種量會使菌種生長迅速，不利于產(chǎn)酶。

2.4 攪拌和溶氧

在培養(yǎng)過程中，提高攪拌速率可增加溶氧，但剪切力則會打散黑曲霉菌絲球［8］，一般情況下，將轉(zhuǎn)速控制在100 ～300 r/min。Hesham 等［25］研究表明，不同的攪拌速率下黑曲霉的生長速率不受影響，但是菌絲形態(tài)有很大的不同。在低攪拌速率(200 r/min)下形成的黑曲霉菌絲球平均直徑為1 500 mm，在攪拌速率為500 r/min時(shí)菌絲球直徑為400 mm，在800 r/min時(shí)菌絲球直徑為24 mm。在攪拌速率為200和500 r/min時(shí)，菌絲球的顆粒個(gè)數(shù)分別是(45±5)和(250±40)個(gè)/ml。這種菌絲球球徑隨轉(zhuǎn)速的提高而減小的結(jié)論與朱虹的研究結(jié)果相一致。但是攪拌速率降低為120 r/min時(shí)，菌絲球的形狀不規(guī)則，由松散的小菌球黏連在一起。這是由于在低轉(zhuǎn)數(shù)下菌絲受到的剪切力較小，生成的菌絲球結(jié)構(gòu)松散、外表不光滑，菌絲球之間很容易粘連形成不規(guī)則的大顆粒。當(dāng)攪拌速率升高為160 r/min時(shí)，形成的菌絲球各方面性能較好。為了避免攪拌的不足，通過調(diào)整通氣量來增加體積輸入功率之比也可以控制菌絲球的直徑和數(shù)量［26］，同時(shí)能生產(chǎn)大量的淀粉酶。Moreira 等［20］采用一個(gè)脈沖流化床生物反應(yīng)器通過控制反應(yīng)器的脈沖形成最適剪切力，提高流化質(zhì)量來控制絲狀真菌形成菌絲球，最后形成均勻的菌絲球，并且提高檸檬酸產(chǎn)量。黑曲霉在0.35 S-1的脈沖生物反應(yīng)器中培養(yǎng)22天后菌絲球直徑保持在(3.3±0.1)mm，而在無脈沖生物反應(yīng)器中培養(yǎng)11 d，菌絲球直徑變?yōu)?6.7±0.3)mm。

2.5 溫度

黑曲霉可以形成菌絲球的溫度范圍比較廣。大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的培養(yǎng)溫度為27℃或者30℃［27］。培養(yǎng)溫度升高(25℃升為30℃)會導(dǎo)致菌絲球的直徑變大。當(dāng)培養(yǎng)溫度提高到35℃時(shí)，不能形成菌絲球，呈現(xiàn)為無序的菌絲體［28］。

2.6 外源添加物

在培養(yǎng)基中添加表面活性劑可以影響菌絲球的生長。吐溫-80使黑曲霉生長的菌絲球松散，直徑變大［29］。添加氧載體可提高黑曲霉的生長和代謝，降低菌絲球的直徑，提高菌絲球的傳質(zhì)。例如正十二烷在濃度分別為0、2.5%、5%(w/v)時(shí)，菌絲球的直徑分別為0.75～1.7 μm、0.65 ～1.30 μm 和 0.55 ～2.05 μm［30］。添加硅酸鹽、Al2O3等小顆?？梢哉{(diào)節(jié)菌絲球直徑的大小［31］。

3 黑曲霉菌絲球的應(yīng)用

3.1 檸檬酸

檸檬酸是世界上產(chǎn)量最大的發(fā)酵產(chǎn)品之一。目前市場上99%以上的檸檬酸都是通過黑曲霉發(fā)酵法生產(chǎn)的，黑曲霉的形態(tài)與產(chǎn)生檸檬酸量有關(guān)系。當(dāng)Mn2+低于14 μg/L時(shí)黑曲霉形成菌絲球且產(chǎn)生大量的檸檬酸。當(dāng)Mn2+高于14 μg/L時(shí)黑曲霉成絲狀分散在溶液中，產(chǎn)生很少的檸檬酸。雖然通過抑制消減雜交技術(shù)(suppression subtractive hybridization)證明有22個(gè)基因?qū)n2+的作用有響應(yīng)，但是對于Mn2+對黑曲霉菌絲形態(tài)和檸檬酸產(chǎn)量的影響還沒有找到明確的分子機(jī)制。Gurpreet Singh Dhillon等［32］對蘋果渣超濾污泥(APS)液態(tài)培養(yǎng)絲狀真菌進(jìn)行了流變剖面的研究，利用黑曲霉NRRL-567在7.5L發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)生檸檬酸。發(fā)酵液的流變學(xué)特性包括菌絲球、控制條件等，證明大量菌絲體使培養(yǎng)液變?yōu)榉桥ｎD假塑性流體。但是添加誘導(dǎo)物甲醇后，在非牛頓液態(tài)培養(yǎng)基中黑曲霉形成菌絲球。

3.2 污水處理

黑曲霉形成的菌絲球具有厭氧顆粒污泥和好氧顆粒污泥所不具備的很多優(yōu)點(diǎn)。第1，菌絲球具有較寬泛的成球和生長條件，具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，能夠抵抗較大的水流剪切力，克服顆粒污泥因形成條件難以控制、維護(hù)過程復(fù)雜而造成的出水水質(zhì)不穩(wěn)定現(xiàn)象。第2，菌絲球沉降性能較好，避免了傳統(tǒng)活性泥水分離不徹底、系統(tǒng)不夠穩(wěn)定的缺點(diǎn)。第3，菌絲球營養(yǎng)需求簡單，生長速度快，沒有二次污染，可以實(shí)現(xiàn)污泥的資源化，降低污泥處理成本。第4，菌絲球由菌絲纏繞而成，表面有許多空隙，利于傳質(zhì)，其吸附COD、重金屬離子及染料的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于普通活性污泥和顆粒污泥。黑曲霉菌絲球在處理含糖類廢水中表現(xiàn)出顆粒透氧性好的特點(diǎn)。雖然顆粒內(nèi)部處在厭氧條件下，使得部分葡萄糖積累，但絕大部分的菌絲球還是暴露在較高的溶氧中，可以維持較好降解能力。菌絲球的底物滲透率優(yōu)于聚乙烯醇硼酸［33］。黑曲霉菌絲球應(yīng)用于含鉻廢水中還原Cr(VI)可以將99.6%Cr(VI)還原［34］，可以處理豆制品廢水56.4%COD［35］和食品工業(yè)廢水中 90%的淀粉［36］。

3.3 蛋白質(zhì)生產(chǎn)

黑曲霉可以生產(chǎn)許多種酶，是美國FDA準(zhǔn)許使用的食品工業(yè)酶的主要生產(chǎn)菌。菌絲球可以降低培養(yǎng)液的黏度，提高吸收底物的速率，所以研究形成菌絲球的方法也是提高黑曲霉產(chǎn)酶性能的一種途徑。例如添加聚硅氧烷來促使黑曲霉形成菌絲球提高纖維素水解的酶類［37］。菌絲球產(chǎn)生蛋白質(zhì)的活性菌絲球是位于菌絲球表層200 μm的部分。目前報(bào)道的黑曲霉菌絲球產(chǎn)生的酶有葡萄糖氧化酶、聚半乳糖醛酸苷酶、植酸酶和淀粉酶。

3.4 單細(xì)胞的收獲

由于黑曲霉菌絲球易于分離的特性，所以被用來收獲單細(xì)胞微生物。有些微藻是用于生物能源制造熱門單細(xì)胞微生物。但是微藻類的直徑在1～30 μm，由于微藻類細(xì)胞小而且分散生長，在技術(shù)上難以利用機(jī)械過濾等方法收獲，收獲過程的成本為總成本的20% ～30%。ZHANG等［38］利用絲狀真菌和微藻類共同培養(yǎng)，絲狀真菌可以使微海藻細(xì)胞包裹在菌絲球上，形成有效的將微藻類與溶液分離的菌絲球的，大幅度降低了生產(chǎn)成本，將這種技術(shù)用于城市廢水處理中，形成的曲霉-微藻類菌絲球直徑為 2～5 mm［39］。

3.5 全細(xì)胞催化過程

菌絲球還作為一種固定化的全細(xì)胞催化劑用于生物轉(zhuǎn)化過程中。例如外消旋的環(huán)氧氯丙烷可以被黑曲霉菌絲球轉(zhuǎn)化為S-環(huán)氧氯丙烷。而且黑曲霉菌絲可以承受環(huán)己烷為溶劑。在這個(gè)轉(zhuǎn)化過程中，連續(xù)流加環(huán)氧氯丙烷也沒有表現(xiàn)出對全細(xì)胞催化劑抑制現(xiàn)象。最終，得到18.5%的S-環(huán)氧氯丙烷［40］。黑曲霉菌絲球作為生物催化劑用于催化沒食子酸生成沒食子酸丙酯的研究中。在以苯為溶劑中反應(yīng)18 h后沒食子酸丙酯得率達(dá)到36.4%［41］。由于黑曲霉可以完成多種特異性的催化反應(yīng)，所以黑曲霉菌絲球作為催化劑具有廣泛的應(yīng)用前景。例如催化的香葉醇苯氨基甲酸酯孤立雙鍵的不對稱雙羥基化反應(yīng)［42］。

4 結(jié)語

由于黑曲霉的安全性好，所以被應(yīng)用于很多領(lǐng)域。黑曲霉在外孢壁上的黑色素和自身分泌的疏水蛋白作用下發(fā)生聚集現(xiàn)象，生成菌絲球。黑曲霉菌絲球的形成在很多應(yīng)用方面起到推動作用，雖然其形成機(jī)理尚未完全清楚，但是其形成條件及應(yīng)用已經(jīng)很廣泛，例如用于有機(jī)酸的生產(chǎn)、水處理、單細(xì)胞的收獲、全細(xì)胞催化過程等諸多方面。

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