單玲玲，高貴珍，曹穩(wěn)根，吳 超，陳紅玲

宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，藥物生物技術(shù)研究所，安徽宿州，234000

靶向抗腫瘤藥物傳遞系統(tǒng)的制備與表征

單玲玲，高貴珍，曹穩(wěn)根，吳 超，陳紅玲

宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，藥物生物技術(shù)研究所，安徽宿州，234000

紫杉醇作為抗惡性腫瘤臨床藥物具有較好的療效，但由于紫杉醇具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜、難溶于水、生物利用度差等缺點，限制了其在臨床上的應(yīng)用。本實驗將多種腫瘤細(xì)胞表面高表達受體的轉(zhuǎn)鐵蛋白作為藥物傳遞系統(tǒng)“導(dǎo)向基團”，以精氨酸為連接轉(zhuǎn)鐵蛋白與紫杉醇藥物的Linker,并用熒光染料FITC標(biāo)記紫杉醇前藥， 制備熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)鐵蛋白-精氨酸-紫杉醇靶向傳遞系統(tǒng)(Tf-FITC-Arg-PTX)，采用TLC示蹤，LC-MS分子量鑒定，紫外分光光度法及SDS電泳進行表征，并用LPSA對制備的藥物傳遞系統(tǒng)進行粒徑大小的考察，實驗結(jié)果證明已成功制備熒光標(biāo)記的靶向抗腫瘤藥物傳遞系統(tǒng)，且轉(zhuǎn)鐵蛋白在修飾前后其粒徑大小沒有明顯的變化。

轉(zhuǎn)鐵蛋白;紫杉醇;熒光標(biāo)記;表征

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類的生命健康，腫瘤的早期診斷與有效治療是當(dāng)前亟待解決的問題。臨床一線抗癌化學(xué)藥多數(shù)為細(xì)胞毒性藥物，存在藥物劑量-療效依賴性，以增加劑量達到較好的藥物療效，這樣加重了藥物毒性反應(yīng)，也限制藥物的臨床應(yīng)用[1]。因此，如何利用靶向性藥物傳遞系統(tǒng)提高抗腫瘤化學(xué)藥物的局部濃度，減小全身毒副作用,一直是研究者的熱門話題。

轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin, Tf)是一種結(jié)合鐵的β-球蛋白，存在于脊椎動物體液及細(xì)胞中，包括血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳轉(zhuǎn)鐵蛋白三種類型，其中血清所含轉(zhuǎn)鐵蛋白含量最多。血清轉(zhuǎn)鐵蛋白含有679個氨基酸殘基，這為修飾蛋白表面提供眾多的活性位點。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Transferrin receptor，TfR)作為一種跨膜糖蛋白，在多種惡性腫瘤細(xì)胞表面(如乳腺癌、膀胱癌、肝癌、肺癌等細(xì)胞)都有高表達[2-3]，且惡性腫瘤細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體與配體的親和力是正常細(xì)胞的10～100倍[4]，因此，可利用轉(zhuǎn)鐵蛋白受體-配體的介導(dǎo)，將藥物靶向傳遞到腫瘤部位，以提高藥物局部濃度，降低藥物的毒性。如Yeh等采用Schiff堿將轉(zhuǎn)鐵蛋白與抗腫瘤藥物阿霉素結(jié)合，實驗結(jié)果證明此藥物傳遞系統(tǒng)可靶向性殺死白血病腫瘤細(xì)胞而對正常血細(xì)胞無毒性[5]。還有一些研究者將轉(zhuǎn)鐵蛋白作為脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)的“導(dǎo)向基團”，實驗結(jié)果表明該系統(tǒng)能減少藥物的副作用，延長藥物在腫瘤部位的滯留時間[6]。

隨著分子影像學(xué)在腫瘤臨床醫(yī)學(xué)上的快速發(fā)展，眾多新型分子影像技術(shù)被研發(fā)出來，其中最引人注目的是利用熒光標(biāo)記技術(shù)制備出不同探針應(yīng)用于腫瘤的早期診斷[7]，監(jiān)測體內(nèi)分子的行為，成像運用的范圍從細(xì)胞、組織發(fā)展到全身水平。熒光染料的種類繁多，常用的熒光染料有異硫氰酸熒光素(FITC)、羥基熒光素(FAM)、四氯熒光素(TET)等，本實驗選用FITC作為標(biāo)記靶向抗腫瘤藥物傳遞系統(tǒng)的熒光染料，為進一步研究藥物傳遞系統(tǒng)在體內(nèi)的代謝途徑提供實驗平臺。

本實驗以轉(zhuǎn)鐵蛋白配體作為藥物傳遞系統(tǒng)“導(dǎo)向基團”，用精氨酸連接轉(zhuǎn)鐵蛋白與紫杉醇，并用熒光染料FITC標(biāo)記紫杉醇前藥，制備熒光標(biāo)記的靶向抗腫瘤藥物傳遞系統(tǒng)。采用TLC在反應(yīng)過程中示蹤，LC-MS分子量鑒定，用紫外分光光度法初步鑒定此藥物傳遞系統(tǒng)的合成，用SDS電泳法證明其結(jié)構(gòu)的組成，使用LPSA研究轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾前與修飾后粒徑大小的變化，為下一步的細(xì)胞和動物實驗打下基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、紫杉醇、精氨酸、熒光染料FITC購買于sigma公司。ZS-紫外分析攝影儀器180(中國遠明公司)，Lambda 35型紫外分光光度儀(上海分析儀器廠)，Zetasizer 3000HSA激光粒度儀(英國馬爾文儀器有限公司)

1.2 精氨酸-紫杉醇(Arg-PTX)的合成

稱取100 mg(0.117 mmol)PTX溶于15 mL的DCM，同時加入113.9 mg (0.140 4 mmol)Fmoc-Arg(pbf)-OH和14.29 mg DMAP(0.117mmol)，將44.85 mg(0.234 mmol,2 eqv)EDC溶于10mL DCM中，在冰浴條件下，將10 mL的EDC溶液緩慢滴入PTX反應(yīng)體系中，大約25 min滴加完畢，除去冰浴，室溫下攪拌22 h。待反應(yīng)完后，用同體積的DCM稀釋，然后用同體積的蒸餾水洗2次，加入無水硫酸鎂干燥，真空旋蒸后得晶狀體產(chǎn)物精氨酸-紫杉醇，其結(jié)構(gòu)用LC-MS進行分子量鑒定。

1.3 FITC-精氨酸-紫杉醇(FITC-Arg-PTX)的制備

將精氨酸-紫杉醇溶于DMF中，加入0.01 mmol FITC, -4℃攪拌3h，將反應(yīng)液經(jīng)G25純化，得到純化的FITC-精氨酸-紫杉醇，用TLC鑒定。

1.4 轉(zhuǎn)鐵蛋白-FITC-精氨酸-紫杉醇藥物傳遞系統(tǒng)(Tf-FITC-Arg-PTX)的制備

先活化FITC-精氨酸-紫杉醇的羧基，加入DCC和NHS(摩爾比 FA∶DCC∶NHS = 1∶1.2∶2)，避光50℃攪拌6 h，反應(yīng)結(jié)束，反應(yīng)液減壓濾過副產(chǎn)物DCU。取上清液，用4倍的丙酮萃取活化的FITC-精氨酸-紫杉醇。然后將活化后的FITC-精氨酸-紫杉醇溶于2mL Tris緩沖液(10 mM，pH8.0)，并加入1 mL含24 mg Tf的Tris溶液，-4℃攪拌6 h，將反應(yīng)液經(jīng)G15純化，去除沒有共價偶聯(lián)的Tf和FITC-精氨酸-紫杉醇片段，得到純化的轉(zhuǎn)鐵蛋白-FITC-精氨酸-紫杉醇藥物傳遞系統(tǒng)，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 轉(zhuǎn)鐵蛋白-FITC-精氨酸-紫杉醇藥物傳遞系統(tǒng)(Tf-FITC-Arg-PTX)的表征

1.5.1 轉(zhuǎn)鐵蛋白-FITC-精氨酸-紫杉醇藥物傳遞系統(tǒng)(Tf-FITC-Arg-PTX)的紫外吸收光譜分析

用紫外吸收光譜對合成的轉(zhuǎn)鐵蛋白-FITC-精氨酸-紫杉醇藥物傳遞系統(tǒng)進行初步表征， Tf、FITC、Arg和PTX的紫外吸收峰分別在260、347、220和227 nm處。用SDS-PAGE進一步考察轉(zhuǎn)鐵蛋白-FITC-精氨酸-紫杉醇藥物傳遞系統(tǒng)共價偶聯(lián)的結(jié)構(gòu)特征。

1.5.2 轉(zhuǎn)鐵蛋白-FITC-精氨酸-紫杉醇藥物傳遞系統(tǒng)(Tf-FITC-Arg-PTX)粒徑大小的測定

轉(zhuǎn)鐵蛋白-FITC-精氨酸-紫杉醇藥物傳遞系統(tǒng)的粒徑及分布情況，可通過馬爾文粒度儀來測定，儀器測定的光源為He激光，檢測波長為633 nm，檢測角度為90°，粒徑測定范圍為2 nm～3 μm。

2 結(jié)果與討論

2.1 精氨酸-紫杉醇前藥(Arg-PTX)結(jié)構(gòu)鑒定

純化后的-NH2-Arg(pbf)-PTX用LC-MS分析，其質(zhì)譜鑒定的結(jié)果與NH2-Arg(pbf)-PTX的理論分子完全一致，-NH2-Arg(pbf)-PTX:MS (ESI,m/z):1285.4([M+Na]+)，如圖1。證明已成功合成精氨酸-紫杉醇前藥。

圖1 精氨酸-紫杉醇前藥用LC-MS的結(jié)構(gòu)鑒定

2.2 FITC-精氨酸-紫杉醇(FITC-Arg-PTX)結(jié)構(gòu)鑒定

圖2顯示，無論是在日光下還在熒光下,Arg-PTX和FITC-Arg-PTX在展開劑乙酸乙酯石∶油醚=3∶1時,所跑出點位置有明顯的區(qū)別，這是由于Arg-PTX的-NH2與FITC-Arg-PTX結(jié)構(gòu)中酰胺鍵極性不同所致，由此可證明FITC-Arg-PTX前藥已成功的合成。在熒光下可以清晰地看到FITC-Arg-PTX前藥中由標(biāo)記物FITC發(fā)出的熒光，證明Arg-PTX已成功標(biāo)記FITC。

圖2 在日光和熒光下FITC-Arg-PTX前藥TLC

2.3 轉(zhuǎn)鐵蛋白-FITC-精氨酸-紫杉醇藥物傳遞系統(tǒng)(Tf-FITC-Arg-PTX)的紫外光譜和電泳圖

純化后Tf-FITC-Arg-PTX藥物傳遞系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)用紫外吸收光譜進行初步鑒定。將純化的Tf-FITC-Arg-PTX分別取一定的量溶于Tris buffer pH 8.0中，并用Tris buffer pH 8.0作為空白校正基線，從Tf-FITC-Arg-PTX化合物的紫外吸收光譜可以看到相應(yīng)Tf、Arg、FITC和PTX的紫外吸收峰值分別在260、220、347和227 nm處,如圖3(A)所示,實驗結(jié)果表明成功地制備Tf-FITC-Arg-PTX藥物傳遞系統(tǒng)。用純化后的Tf-FITC-Arg-PTX化合物進行SDS-PAGE，以Tf作為Marker，跑出的Tf和Tf-FITC-Arg-PTX兩個電泳條帶在同一條直線上，說明用FITC-Arg-PTX修飾Tf，并沒有影響Tf的分子量，這是因為Tf的分子量有76.5kD，F(xiàn)ITC-Arg-PTX的分子量與其相比可以忽略不計。將SDS-PAGE電泳條帶放在熒光下，可以看到FITC的熒光，進一步地證明FITC-Arg-PTX與Tf成功地共價偶聯(lián)，如圖3(B)所示。

圖3 表征Tf-FITC-Arg-PTX化合物

2.4 轉(zhuǎn)鐵蛋白-FITC-精氨酸-紫杉醇藥物傳遞系統(tǒng)(Tf-FITC-Arg-PTX)粒徑的特征

對轉(zhuǎn)鐵蛋白-FITC-精氨酸-紫杉醇藥物傳遞系統(tǒng)修飾之后粒徑變化的考察，主要是通過LPSA來衡量。Tf和Tf-FITC-Arg-PTX化合物的粒徑分布經(jīng)馬爾文粒度儀測定，分別是(4.3±1.7)nm和(4.2±1.3)nm，表明兩種蛋白顆粒的粒徑?jīng)]有差異，說明化學(xué)修飾法對Tf蛋白粒徑大小沒有影響。

3 結(jié) 論

本實驗制備轉(zhuǎn)鐵蛋白-FITC-精氨酸-紫杉醇藥物傳遞系統(tǒng)，并用熒光染料FITC標(biāo)記紫杉醇藥物傳遞系統(tǒng)，為下一步細(xì)胞和動物實驗提供實驗平臺。實驗結(jié)果顯示已成功地合成紫杉醇靶向藥物傳遞系統(tǒng)。

[1]Ten Tije AJ, Verweij J, Loos WJ, et al. Pharmacological effects of formulation vehicles:implications for cancer chemotherapy[J]. Clin Pharmacokinet,2013,42:665-685

[2]Sahoo SK,labhasetwar V.Enhanced Antiproliferative Activity of Transferrin-Conjugated Paclitaxel-Loaded Nanoparticles Is Mediated via Sustained Intracellular Drug Retention[J]. Mol Pharm, 2012,6:373-383

[3]Bicamumpaka C, PagéIn M. In vitro cytotoxicity of paclitaxel-transferrin conjugate on H69 cells[J].Oncol Rep,1998,5:1381-1384

[4]張莉，徐維平，蘇育德，等.轉(zhuǎn)鐵蛋白-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在腫瘤主動靶向治療中的應(yīng)用[J].中國藥業(yè),2012(5):56-58

[5]Yeh C-JG, Faulk WP. Killing of human tumor cells in culture with adriamycin conjugates of human transferring[J]. Clin Immunol Immunopathol, 1984, 32:1-11

[6]Lin Wu,Jinhui Wu,Yuanyuan Zhou,et al.Enhanced antitumor efficacy of cisplatin by tirapazamine-transferrin conjugate[J].Int J Pharm, 2012,15:2253-2268

[7]張琳華,何穎娜,馬桂蕾.葉酸靶向紫杉醇聚合物納米囊泡的制備及其抗腫瘤活性研究[J].中國藥學(xué)雜志，2010,45(22):1742-1748

(責(zé)任編輯：汪材印)

2014-10-12

安徽省自然科學(xué)基金項目(1308085MH136)；安徽省教育廳自然科學(xué)重點研究項目(KJ2014A249，KJ2013A242)

單玲玲(1971-)，女，安徽宿州人，博士，副教授，主要研究方向：腫瘤靶向探針及藥物的合成。

10.3969/j.issn.1673-2006.2014.12.025

R914.2

A

1673-2006(2014)12-0085-03