HPLC–MS/MS法測定南美白對蝦苗中硝基呋喃類代謝物殘留*

鄭丹，楊家鋒，鐘惠英，姜小敏

（寧波市漁業(yè)環(huán)境與產(chǎn)品質(zhì)量檢驗監(jiān)測中心，浙江寧波 315012）

硝基呋喃類藥物(Nitrofuran antibiotics)作為一類廣譜抗生素被廣泛應(yīng)用于動物飼料和治療藥物中，由于硝基呋喃在治療動物腸胃病方面效果明顯，故被應(yīng)用于南美白對蝦育苗環(huán)節(jié)。研究表明該類藥物可能誘導有機體基因突變且具有遺傳毒性，歐美等國已將其列為違禁藥物，我國也將其列為食品動物的禁用獸藥。硝基呋喃類藥物主要包括呋喃唑酮(Furanzolidone)、呋喃西林(Nitrofurazone)、呋喃妥因(Furantoin)、呋喃它酮(Furaltadone)4種，該類藥物在動物體內(nèi)會迅速分解，其代謝物可與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合形成穩(wěn)定殘留，因此目前通常以測定其代謝物的方式來說明硝基呋喃類藥物在動物體內(nèi)的含量［1-10］。

南美白對蝦是寧波市水產(chǎn)養(yǎng)殖主導產(chǎn)業(yè)之一，是寧波市水產(chǎn)品出口創(chuàng)匯的少數(shù)優(yōu)勢品種，因此保證南美白對蝦的食用安全對于保障百姓身體健康和擴大出口至關(guān)重要。隨著百姓對食品安全問題的日益關(guān)注以及政府對水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管的重視，水產(chǎn)苗種作為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)重要的投入品，它的安全關(guān)系到水產(chǎn)品安全問題的源頭，也是各級漁業(yè)行政主管部門主抓的工作之一，因此測定南美白對蝦苗中的硝基呋喃類抗生素代謝物有重要意義。

近年來高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)越來越多地應(yīng)用于硝基呋喃類代謝物殘留的測定，與高效液相色譜紫外檢測器法比較，質(zhì)譜檢測技術(shù)采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，結(jié)合液相保留時間及MRM特征離子對進行定性和定量分析，可以大大減少由于保留時間相同而待測離子不同所帶來的干擾，并且提高了檢測靈敏度，尤其適合于基質(zhì)復雜樣品的分析，將這一技術(shù)應(yīng)用于南美白對蝦苗種硝基呋喃類代謝物殘留測定，將有利于漁業(yè)行政主管部門對水產(chǎn)苗種企業(yè)的監(jiān)管和水產(chǎn)品質(zhì)量安全的提升［11-17］。目前尚無高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)測定南美白對蝦苗種中硝基呋喃類抗生素代謝物的相關(guān)報道。筆者對該方法進行了研究，確定了實驗條件，所建方法測定結(jié)果的精密度和準確度滿足藥物殘留檢測要求。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：Waters 2695-Quattro micro mass型，美國Waters公司；

超聲波清洗機：KS-120D型，寧波科生公司；

均質(zhì)機：DJ-Ⅱ型，上海炳隆機電公司；

漩渦混勻儀：MS3數(shù)顯型，德國IKA公司；

恒溫水浴搖床：SHA-C型，常州國華公司；

臺式離心機：DL-8M型，上海離心機械研究所；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R215型，瑞士BUCHI公司；

分析天平：BP211D Ma型，感量為0.000 1 g，德國Sartorius公司；

乙酸乙酯：分析純；

乙腈、甲酸、2-硝基苯甲醛：色譜純；

鹽酸溶液：0.2 mol/L；

氫氧化鈉溶液：2.0 mol/L。

1.2 標準溶液配制

表1列出了硝基呋喃代謝物的名稱。

表1 硝基呋喃代謝物名稱及縮寫

AOZ，AMOZ，SEM ·HCl，AHD ·HCl標準物質(zhì)：純度不低于98%；

同位素內(nèi)標溶液：AOZ-D4，AMOZ-D5，AHD-13C3和 SEM ·HCl-13C-15N2，質(zhì)量濃度均為 100 μg/mL ；

AOZ，AMOZ，SEM，AHD標準儲備溶液：質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL，分別準確稱取一定量AOZ，AMOZ，SEM，AHD，用甲醇溶解并分別定容至10 mL棕色容量瓶中，4℃冷藏保存；

混合標準工作溶液：準確吸取AOZ，AMOZ,SEM,AHD標準儲備溶液，用流動相[乙腈-甲酸緩沖溶液（體積比20∶80）]逐級稀釋配制成100 ng/mL和10 ng/mL混合溶液，于4℃冷藏保存；

混合內(nèi)標工作溶液：準確吸取同位素內(nèi)標溶液，用甲醇逐級稀釋配成50 ng/mL混合溶液，于4℃冷藏保存。

1.3 樣品采集

南美白對蝦苗及對應(yīng)苗池水樣品取自2007～2011年每年4～5月間，樣品采集覆蓋了寧波市慈溪、寧海、象山、鄞州、奉化等南美白對蝦苗主要生產(chǎn)區(qū)，涵蓋了寧波市大型育苗場的95%，抽取苗種規(guī)格均為0.7～1.0 cm仔蝦。

1.4 樣品前處理

取南美白對蝦苗樣用均質(zhì)機制成均質(zhì)糜樣備用，稱取樣品2.0 g(精確到0.01 g)于50 mL離心管中，加入200 μL混合內(nèi)標工作溶液，再加入10 mL 0.2 mol/L 鹽酸溶液和 100 μL 2-硝基苯甲醛，渦旋振蕩50 s后，置于恒溫水浴振蕩器中37℃避光振蕩16 h。取出離心管冷卻至室溫，加入1.0 mol/L氫氧化鈉溶液約2.0 mL，再調(diào)節(jié)pH至7.0～7.5，加入 10 mL 乙酸乙酯，渦旋振蕩 50 s，以4 000 r/min 離心5 min，取上層清液轉(zhuǎn)移至50 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，再加入10 mL乙酸乙酯，重復上述操作，合并上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，準確加入1.0 mL乙腈-甲酸緩沖溶液（體積比20∶80），渦旋振蕩溶解殘留物，過0.45 μm濾膜，待測。標準工作曲線制作時，用100 ng/mL和10 ng/mL混合標準工作液配制系列標準使用液，不加樣品，其余等同樣品前處理過程。

1.5 儀器工作條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱：SHISEIDO MGⅢC18柱(2.0 mm×100 mm)；流動相：乙腈-甲酸緩沖溶液(體積比20∶80），梯度洗脫（洗脫程序見表2），流速為0.2 mL/min；柱溫：30℃；進樣體積：10 μL；進樣時間：20 min。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子化模式：大氣壓電噴霧離子源（ESI），正離子模式；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣流：600 L/h；掃描模式：選擇反應(yīng)監(jiān)測模式；選擇反應(yīng)監(jiān)測母離子、子離子和碰撞能量見表3。

表2 流動相梯度洗脫程序

表3 選擇反應(yīng)監(jiān)測4種硝基呋喃類藥物代謝物的質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生化時間對回收率的影響

衍生化時間的設(shè)定對樣品測定結(jié)果有很大影響，如圖1所示。實驗發(fā)現(xiàn)衍生化時間超過12 h后，AOZ，SEM回收率較好且穩(wěn)定，而AMOZ，AHD衍生時間達到16 h才有穩(wěn)定的回收率。當衍生時間小于12 h時，4種硝基呋喃類代謝物不能保證每次都衍生完全，盡管AOZ在衍生化6 h就能有較好回收率，但回收率并不穩(wěn)定，且并未隨時間的延長而呈比例增大。因此同時測定硝基呋喃4種代謝物時，應(yīng)選擇衍生時間大于16 h。

圖1 不同衍生化時間對回收率的影響

2.2 色譜柱的選擇

考察了Waters atlantis C18(2.1 mm×150 mm)柱和SHISEIDO MGⅢC18(2.0 mm×100 mm)柱對待測物的分離效果，結(jié)果表明，SHISEIDO MGⅢC18柱靈敏度高于waters atlantisC18柱，而waters atlantisC18柱的穩(wěn)定性較好，綜合考慮選擇SHISEIDO MGⅢC18柱。

2.3 流動相的選擇

考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-2 mmol/L乙酸銨、乙腈-1‰甲酸溶液等不同流動相對4種硝基呋喃代謝物的色譜行為和離子化程度的影響。結(jié)果表明，以乙腈-1‰甲酸溶液作為流動相時，可獲得最優(yōu)的色譜分離效果和質(zhì)譜信號響應(yīng)。

2.4 工作曲線方程、檢出限和定量限

配制質(zhì)量濃度為0.2～50 ng/mL的系列標準溶液，按照樣品的前處理方法進行衍生化和提取后，利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進行測定。以色譜峰面積(Y)對被測組分的質(zhì)量濃度(X)進行線性回歸，AOZ，AHD，SEM，AMOZ的回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表4。在陰性樣品基質(zhì)中添加4種標準溶液（AOZ，AMOZ的添加水平為0.10 μg/kg，SEM，AHD的添加水平為0.25 μg/kg），當信噪比(S/N)大于5時，計算AOZ，AMOZ的檢出限為0.10 μg/kg，SEM，AHD的檢出限為0.25 μg/kg。在陰性樣品基質(zhì)中添加4種標準溶液（AOZ，AMOZ的添加水平為0.40 μg/kg，SEM，AHD的添加水平為0.50 μg/kg），當信噪比 (S/N)大于 10時計算 AOZ，AMOZ的定量下限為0.40 μg/kg，SEM，AHD的定量下限為 0.50 μg/kg，見表 4。

表4 工作曲線方程、線性范圍、檢出限和定量限

2.5 方法回收率和精密度試驗

選取陰性樣品，添加4種硝基呋喃類代謝物標準品和相應(yīng)內(nèi)標，添加水平為 2.50，10.0 μg/kg，每個水平做6個平行加標回收試驗，結(jié)果見表5。

表5 回收率和精密度試驗結(jié)果(n=6)

由表5可知，加標回收率為88.2%～97.6%，相對標準偏差為4.6%～6.8%，由此可見方法的精密度和準確度較高。

3 結(jié)語

采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了南美白對蝦苗的硝基呋喃類代謝物測定方法，對樣品前處理的提取凈化條件、液相色譜分離條件和串聯(lián)質(zhì)譜測定條件進行了優(yōu)化。該方法具有穩(wěn)定性好、靈敏度高的特點，其線性、準確度和精密度均能滿足藥物殘留測定要求。該方法樣品前處理過程簡單、凈化效果好，適合于大批量樣品的快速檢測，該研究為政府相關(guān)部門對南美白對蝦苗硝基呋喃類代謝物的監(jiān)督提供了參考。

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