潘靈鋒,趙雙雙

(湖北師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院， 湖北 黃石 435002)

家蠅幼蟲(chóng)抗菌物質(zhì)的誘導(dǎo)及抗菌活性研究

潘靈鋒,趙雙雙

(湖北師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院， 湖北 黃石 435002)

針刺家蠅三齡幼蟲(chóng)誘導(dǎo)其體內(nèi)產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，利用乙酸銨和硫酸銨鹽析方法提取純化家蠅三齡幼蟲(chóng)體內(nèi)產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)，并進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)，通過(guò)測(cè)量其抑菌圈的大小來(lái)確定其抑菌能力的強(qiáng)弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：家蠅三齡幼蟲(chóng)經(jīng)針刺誘導(dǎo)后能產(chǎn)生抗菌物質(zhì); 經(jīng)初步鑒定該抗菌物質(zhì)為蛋白質(zhì)或多肽，且具有熱穩(wěn)定性。

家蠅幼蟲(chóng)；針刺；抗菌物質(zhì)；抑菌圈

家蠅(Musca domestica)隸屬昆蟲(chóng)綱、雙翅目、環(huán)裂亞目、家蠅科,其種類繁多，對(duì)人類的危害主要是傳播疾病。研究發(fā)現(xiàn)家蠅能攜帶 60多種細(xì)菌，一只家蠅的體表可沾有百萬(wàn)個(gè)細(xì)菌，最多的可攜帶五億左右個(gè)細(xì)菌[1～3]?？茖W(xué)家研究發(fā)現(xiàn)，家蠅其體表及腹中攜帶數(shù)以萬(wàn)計(jì)的細(xì)菌、病毒以及寄生蟲(chóng)卵，但不得病，其原因可能在于家蠅體內(nèi)能產(chǎn)生多種抗病菌和抗病毒的有效物質(zhì)[4，5]。本文是以家蠅3齡幼蟲(chóng)為原材料，采用針刺損傷法誘導(dǎo)，除使原有抗菌蛋白的表達(dá)獲得增強(qiáng)外，還激活了新蛋白的產(chǎn)生，這種新蛋白可能也具有抗菌活性。針刺誘導(dǎo)后利用乙酸銨對(duì)家蠅3齡幼蟲(chóng)體內(nèi)產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)進(jìn)行提取，并利用提取物作用于細(xì)菌培養(yǎng)物，通過(guò)測(cè)量其抑菌圈的大小來(lái)確定其抑菌能力的強(qiáng)弱[6～8]。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 家蠅幼蟲(chóng) 采集自野外，經(jīng)誘集飼料(配方：95%玉米粉 +5%酵母粉，用水拌濕)誘集家蠅產(chǎn)卵，卵孵化后于實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，產(chǎn)生3齡幼蟲(chóng)。

1.1.2 供試微生物 革蘭氏陰性菌：大腸桿菌，革蘭氏陽(yáng)性菌：金黃色葡萄球菌(來(lái)源于湖北師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院)。

1.1.3 試劑及溶液 蔗糖、氯化鈉、蛋白胨、酵母提取物、氫氧化鈉、硫酸銨、硫酸銅、乙酸銨。

1)家蠅幼蟲(chóng)體內(nèi)抗菌物質(zhì)提取劑 乙酸銨緩沖液(0.05、0.1、0.2、0.5mol/L)、0.9%的生理鹽水、乙酸銨緩沖液與0.9%的生理鹽水混合液(1∶1).

2)家蠅幼蟲(chóng)體內(nèi)抗菌物質(zhì)純化劑 飽和硫酸銨溶液。

3)家蠅幼蟲(chóng)體內(nèi)抗菌物質(zhì)成分鑒定試劑 10%NaOH溶液、1%CuSO4溶液。

1.1.4 培養(yǎng)基 LB(Luria．Bertani)液體培養(yǎng)基、LB(Luria．Benani)固體培養(yǎng)基、PDA固體培養(yǎng)基、麩皮培養(yǎng)基。

1.2方法

1.2.1 家蠅3齡幼蟲(chóng)的免疫誘導(dǎo)

1)誘導(dǎo)劑的制備：各取等體積的擴(kuò)培后的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌液5mL，4，000轉(zhuǎn)/min，離心5min，棄上清液后，加入1mL的0.9%無(wú)菌生理鹽水重新懸浮沉淀，作為誘導(dǎo)劑，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2)家蠅幼蟲(chóng)的針刺誘導(dǎo)：取家蠅3齡幼蟲(chóng)，75%酒精體表消毒后，用蘸取誘導(dǎo)劑的針刺其腹部，將其放置在飼養(yǎng)室內(nèi)飼養(yǎng)24h，喂食人工飼料(95%玉米粉 和5%酵母粉，并含有相應(yīng)的誘導(dǎo)源，使其在有誘導(dǎo)源的環(huán)境下生長(zhǎng))。

1.2.2 家蠅幼蟲(chóng)抗菌物質(zhì)的提取與純化

1)家蠅幼蟲(chóng)抗菌物質(zhì)的提取 稱取一定量家蠅3齡幼蟲(chóng)利用蘸取誘導(dǎo)劑進(jìn)行針刺，另取等量未經(jīng)針刺誘導(dǎo)的家蠅3齡幼蟲(chóng)作為對(duì)照，蒸餾水清洗后干燥，分別放入4℃預(yù)冷的研缽中，按1∶5的比例(重量體積比)加入相應(yīng)體積的4℃預(yù)冷提取緩沖液。冰浴上充分研磨成漿后，4，000轉(zhuǎn)/min，離心5min，以去除血細(xì)胞和其它組織沉淀，收集上清，并在4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2)家蠅幼蟲(chóng)抗菌物質(zhì)的純化 利用0.2M的乙酸銨溶液對(duì)誘導(dǎo)后的家蠅3齡幼蟲(chóng)體內(nèi)的抗菌物質(zhì)進(jìn)行提取(粗提取物)，再將獲得的粗提物進(jìn)行75℃加熱處理， 10000轉(zhuǎn)/min離心5min，收集上清，緩慢的向上清中加入飽和硫酸銨，攪拌混勻，使其硫酸銨的終濃度達(dá)到50%， 4℃冰箱中靜置4 h，10000×g離心5min，取沉淀，再將沉淀溶于0.2M的乙酸銨緩沖液中， 4 ℃，透析袋 (8 000～ 15 000)透析過(guò)夜, 將透析好的粗提液4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 家蠅幼蟲(chóng)產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的抗菌活性檢測(cè)

采用濾紙片法：在平板上貼上1cm左右的無(wú)菌濾紙片，然后在濾紙片上點(diǎn)加待測(cè)抗菌物質(zhì)粗提取液50μL，以同體積未經(jīng)針刺誘導(dǎo)的家蠅3齡幼蟲(chóng)提取液作為陰性對(duì)照，室溫下待樣品完全擴(kuò)散后，于37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，觀察并測(cè)量抑菌圈直徑，并計(jì)算抑菌比(用來(lái)表明抗菌活性的強(qiáng)弱)。

1.2.4 家蠅幼蟲(chóng)免疫誘導(dǎo)后產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的初步鑒定

采用雙縮脲反應(yīng)方法檢測(cè)：取一支試管，向試管中加入純化后具有抗菌作用的粗提取液100μL，再滴加10%NaOH溶液10滴及1%CuSO4溶液2滴，混勻，觀察是否出現(xiàn)紫紅色，以確定提取物純化后，溶液中的主要成分為蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1家蠅幼蟲(chóng)免疫誘導(dǎo)后產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的抑菌活性的檢測(cè)

對(duì)于利用蘸取誘導(dǎo)劑進(jìn)行針刺誘導(dǎo)(處理)或未經(jīng)針刺誘導(dǎo)(對(duì)照)的家蠅3齡幼蟲(chóng)提取液，利用濾紙片法檢測(cè)其抑菌效果(見(jiàn)圖1)。

圖1A中：經(jīng)針刺誘導(dǎo)家蠅幼蟲(chóng)的提取液對(duì)大腸桿菌(G-)的抑菌圈大小(直徑)為13mm(濾紙片大小為11mm)，表明提取液中有抗菌物質(zhì)產(chǎn)生；

圖1B中：經(jīng)針刺誘導(dǎo)家蠅幼蟲(chóng)的提取液對(duì)金黃色葡萄球菌(G+)的抑菌圈大小為17mm(濾紙片大小為11mm)，表明提取液中有抗菌物質(zhì)產(chǎn)生；

圖1C中：未經(jīng)針刺誘導(dǎo)家蠅幼蟲(chóng)的提取液對(duì)大腸桿菌(G-)的抑菌圈大小為0mm，說(shuō)明未經(jīng)針刺誘導(dǎo)家蠅幼蟲(chóng)的提取液對(duì)大腸桿菌(G-)無(wú)抗菌效果，表明提取液中無(wú)抗菌物質(zhì)產(chǎn)生；

圖1D中：未經(jīng)針刺誘導(dǎo)家蠅幼蟲(chóng)的提取液對(duì)金黃色葡萄球菌(G+)的抑菌圈大小為0mm，說(shuō)明未經(jīng)針刺誘導(dǎo)家蠅幼蟲(chóng)的提取液對(duì)金黃色葡萄球菌(G+)無(wú)抗菌效果，表明提取液中無(wú)抗菌物質(zhì)產(chǎn)生。

濾紙片法抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示家蠅幼蟲(chóng)經(jīng)針刺免疫誘導(dǎo)后產(chǎn)生了抗菌物質(zhì)，該抗菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌(G+)的抑菌效果比對(duì)大腸桿菌(G-)的抑菌效果好。抑菌效果可用抑菌比(抑菌圈的大小/濾紙片大小)來(lái)表示(見(jiàn)表1)。

圖1 家蠅幼蟲(chóng)針刺誘導(dǎo)/未針刺誘導(dǎo)提取液的抑菌效果

A：針刺誘導(dǎo)家蠅幼蟲(chóng)的提取液對(duì)大腸桿菌(G-)的抑菌效果；

B：針刺誘導(dǎo)家蠅幼蟲(chóng)的提取液對(duì)金黃色葡萄球菌(G+)的抑菌效果；

C：未經(jīng)針刺誘導(dǎo)家蠅幼蟲(chóng)的提取液對(duì)大腸桿菌(G-)的抑菌效果；

D：未經(jīng)針刺誘導(dǎo)家蠅幼蟲(chóng)的提取液對(duì)金黃色葡萄球菌(G+)的抑菌效果。

表1 家蠅幼蟲(chóng)針刺誘導(dǎo)/未經(jīng)針刺誘導(dǎo)提取液的抑菌效果(抑菌比)

2.2家蠅幼蟲(chóng)免疫誘導(dǎo)后產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的初步鑒定

家蠅幼蟲(chóng)經(jīng)免疫誘導(dǎo)后的提取液進(jìn)行雙縮脲反應(yīng)，試管中加入純化后的粗提取液，再滴加NaOH溶液后沒(méi)有任何現(xiàn)象產(chǎn)生，當(dāng)加入CuSO4溶液后，上層略顯藍(lán)色，下層清澈，當(dāng)混勻后，可以觀察到溶液由藍(lán)色變成紫紅色，其結(jié)果表明家蠅幼蟲(chóng)經(jīng)免疫誘導(dǎo)后的提取液純化后，溶液中的主要抗菌成分初步鑒定為蛋白質(zhì)或多肽。

3 分析

1)家蠅3齡幼蟲(chóng)體內(nèi)的抗菌物質(zhì)是在針刺誘導(dǎo)的情況下才大量的表達(dá)，該抗菌物質(zhì)經(jīng)初步鑒定其主要成分為蛋白質(zhì)或多肽，對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均具有良好的抗菌作用；

2)本研究以家蠅3齡幼蟲(chóng)為原材料，利用誘導(dǎo)劑進(jìn)行針刺誘導(dǎo)，使其體內(nèi)抗菌基因表達(dá)，產(chǎn)出抗菌物質(zhì)，該抗菌提取物經(jīng)75℃加熱5min處理后，仍然保持良好的抑菌活性，表明家蠅體內(nèi)的抑菌物質(zhì)具有較強(qiáng)的耐熱性；

3)該抗菌物質(zhì)經(jīng)初步鑒定其主要成分為蛋白質(zhì)或多肽，還需通過(guò)陽(yáng)離子交換層析、親和層析進(jìn)一步純化，通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定，利用IEF-PAGE進(jìn)行等電點(diǎn)的測(cè)定以及凝血活性檢測(cè)是否有凝血反應(yīng)等性質(zhì)，對(duì)具有抗菌活性的蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，為廣譜抗菌新藥開(kāi)發(fā)打下基礎(chǔ)。

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Keywords: the third instar of housefly；acupuncture；antibiotic substance；inhibition zone

ThestudyfortheinducementofantibacterialsubstancesandtheirantibacterialactivityinMuscadomesticalarvae

PAN Ling-feng , ZHAO Shuang-shuang

(College of Life Sciences, Hubei Normal University, Huangshi 435002,China)

This paper explored the antibiotic substance induced by acupuncture on the third instar of housefly. The method of ammonium acetate and ammonium sulfate was used for purifying the antibiotic substance which produce by the third instar, and antibacterial experiment was conducted after the purification. The bacteriostatic ability was measured by the size of the inhibition zone. The results showed that the antibiotic substance was produced after the induction of acupuncture, and the chemical nature of the antibiotic substance was protein or polypeptides via the preliminary identification.

2014—01—10

潘靈鋒(1991— )，男，湖北黃石人.

Q93

A

1009-2714(2014)02- 0074- 04

10.3969/j.issn.1009-2714.2014.02.017