八聚精氨酸修飾的載ASODN脂質(zhì)體的構(gòu)建及體外評價(jià)

， ，

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

反義寡核苷酸(Antisense oligodeoxynucleotide，ASODN)是根據(jù)核酸雜交原理設(shè)計(jì)，能夠選擇性抑制特定基因表達(dá)的核苷酸序列[1].ASODN以其安全性高，設(shè)計(jì)簡便，合成容易，能特異性地作用于異?；虻奶攸c(diǎn)，已在基因治療領(lǐng)域取得飛速發(fā)展.然而，ASODN不能穿過生物膜進(jìn)入靶部位與靶分子結(jié)合，限制了它的臨床應(yīng)用.如何有效地將基因藥物傳遞至細(xì)胞內(nèi)已成為基因治療廣泛應(yīng)用急需解決的瓶頸問題之一[2].非病毒類載體由于具有ASODN攜載率高、免疫原性低、易大量制備等優(yōu)點(diǎn)，已成為近年來ASODN載體研究開發(fā)的主要方向之一.脂質(zhì)體具有良好的生物相容性﹑低毒性以及表面可修飾的特性，近年來已成為非病毒基因載體的首選[3].與病毒載體相比，脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率明顯偏低.為了提高脂質(zhì)體的細(xì)胞攝取效率，常對其表面進(jìn)行修飾.八聚精氨酸(R8)是在TAT49-57寡肽的基礎(chǔ)上，篩選出的具有較強(qiáng)穿膜能力的膜活性肽，經(jīng)其修飾的載體入胞效率可顯著提高[4].基于以上研究成果，在普通脂質(zhì)體中插入硬脂酰-R8，并對其理化性質(zhì)和入胞效率進(jìn)行評價(jià)，以期獲得高效低毒的非病毒基因載體.

1 儀器與材料

1.1 儀 器

REV-52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司)；ELWD0.3 T1-SNCP三目倒置相差顯微鏡(Nikon)；SpectraMax M2e多功能酶標(biāo)儀(美國分子儀器公司)；SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵(河南省太康科教器材廠)；DelsaNano激光粒度測定儀(Beckman公司)；JY92超聲細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝科技研究所)；GL-88D渦旋混合器(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)；3111二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Thermo ELECTRON COPOERATION).

1.2 材 料

大豆卵磷脂S100(德國Lipoid公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)；膽固醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；MTT(美國Sigma公司)；胎牛血清(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)；胰酶(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)；DMEM(含雙抗，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)；肝癌細(xì)胞(HepG-2)和肺癌細(xì)胞(A549)(浙江工業(yè)大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室提供)；口腔上皮癌細(xì)胞(KB)(中科院上海細(xì)胞所)；FITC-反義寡核苷酸(ASODN，序列為FITC-GGAGCGCGCGGCATCGCGG，上海生工技術(shù)服務(wù)有限公司)；硬脂酰八聚精氨酸(R8，上海生工技術(shù)服務(wù)有限公司)；其他均為分析純試劑.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 硬脂酰-R8修飾脂質(zhì)體的制備

稱取大豆磷脂100 mg和膽固醇50 mg，加10 mL氯仿溶解，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸餾成膜(溫度25 ℃，真空度-0.95 MPa).加入10 mL超純水劇烈振搖使膜脫落，在40 ℃下水化2 h，探頭超聲(工作3 s，間歇3 s，功率400 W，數(shù)量200次)，0.45 μm微孔濾膜過濾，稀釋至10 mL即得磷脂質(zhì)量濃度為10 mg/mL的空白脂質(zhì)體(NLip)[5-6].

硬脂酰八聚精氨酸用超純水溶解，并稀釋成一系列的濃度，分別與空白脂質(zhì)體等體積混合，并在45 ℃下孵育1 h，即得R8濃度不同的R8-Lip.

2.2 粒徑和Zeta電位的測定

NLip和R8-Lip用PBS稀釋成2.5 mg/mL，用粒度測定儀測定其粒徑和Zeta電位.檢測條件和參數(shù)：溫度25 ℃，平衡時(shí)間2 min，介質(zhì)折光率為1.33，粘度為0.895 mPas.

2.3 R8-Lip/ASODN的結(jié)合率

采用瓊脂糖凝膠阻滯試驗(yàn)來判斷R8-Lip/ASODN復(fù)合物的形成情況[7].取適當(dāng)質(zhì)量濃度的R8-Lip與0.100 mg/mL ASODN等體積混合并且旋渦震蕩混勻，使其中+/-電荷比(以ASODN中的P(-)和R8中的N(+)計(jì))分別為1∶2，1∶1，4∶1，8∶1，16∶1，32∶1，室溫孵育30 min，使R8-Lip與ASODN完全結(jié)合.取15 μL ASODN/R8-Lip復(fù)合物與3 μL 6×DNA電泳加樣緩沖液混勻，從中取15 μL加于上樣孔中，以相同濃度的游離ASODN作對照.電泳條件：瓊脂糖凝膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%，電壓80 mV，時(shí)間10 min，顯色劑為溴化乙錠.置于紫外燈下觀察，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存.

2.4 R8-Lip的細(xì)胞毒性

用溴化四氮唑比色法(MTT Assay)[8-9]評估R8-Lip的細(xì)胞毒性.將HepG-2細(xì)胞消化后，用含10%血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋成5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，并以100 μL/孔接種于96孔板中,37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜.當(dāng)細(xì)胞貼壁完全并且處于對數(shù)生長期，棄去舊的培養(yǎng)液，用冷的pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗一次，然后加入一定量的R8-Lip和不含血清的DMEM培養(yǎng)基，使得R8的終質(zhì)量濃度分別為0,0.5,2,5,10,20,40 μg/mL，Lip的最終質(zhì)量濃度為20 μg/mL.最終每孔總體積為150 μL，平行設(shè)置6個(gè)復(fù)孔.培養(yǎng)5h后，棄去舊培養(yǎng)液，按100 μL/孔的量加入1 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng).4 h后，吸去MTT培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，輕輕振搖10 min使結(jié)晶溶解完全，設(shè)調(diào)零孔(每孔150 μL DMSO)，以沒加脂質(zhì)體復(fù)合物孔為對照，測定570 nm處的吸光度.在KB細(xì)胞和A549細(xì)胞中以相同方法考察載體毒性.細(xì)胞存活率計(jì)算公式為

其中:A570(樣品)為R8濃度不同的樣品孔的吸光度；A570(對照)為對照孔的吸光度.

2.5 R8-Lip對細(xì)胞攝取ASODN的促進(jìn)作用

將HepG-2細(xì)胞消化后，用含10%血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋成5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，并以200 μL/孔接種于96孔板中,37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜.當(dāng)細(xì)胞貼壁完全并且處于對數(shù)生長期，棄去舊的培養(yǎng)液，用冷的pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗一次.取適量R8-Lip/ASODN復(fù)合物加入培養(yǎng)孔中，補(bǔ)充不含血清的DMEM培養(yǎng)基使每孔終體積為150 μL，ASODN的最終質(zhì)量濃度為1 μg/mL，R8-Lip的最終質(zhì)量濃度(以R8計(jì))分別為0.3,0.6,2.4,4.8,9.6 μg/mL，即R8-Lip/ASODN復(fù)合物中+/-分別為1∶2，1∶1，4∶1，8∶1，16∶1，每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)復(fù)孔，同時(shí)以lipofectamine 2000組和游離ASODN組為對照.37 ℃和5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，然后棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗3遍，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照[10].以相同方法考察KB和A549細(xì)胞株中載體對ASODN攝取的促進(jìn)作用.

3 結(jié)果與討論

3.1 粒徑和zeta電位

從表1和圖1中可以看出:NLip和R8-Lip的粒徑及其分布差異不大，該結(jié)果證明脂質(zhì)體經(jīng)R8修辭后，基本不改變其粒徑和分布.NLip和R8-Lip的zeta電位存在明顯的差別，NLip電位為-10.24 mV，而R8-Lip電位為+38.69 mV.結(jié)果表明：帶正電的R8和帶負(fù)電的NLip通過孵育，使得R8成功地插到磷脂雙分子層中，使得普通脂質(zhì)體表面的電性發(fā)生翻轉(zhuǎn)，從而具備了作為基因載體的潛力.

表1 NLip和R8-Lip的粒徑和zeta電位

圖1 NLip和R8-Lip的粒徑及其分布

3.2 R8-Lip/ASODN的結(jié)合率

圖2為不同+/-時(shí)的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從左到右依次是ASODN；R8-Lip/ASODN復(fù)合物+/-=2∶1，1∶1，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32.從圖2中可以看出：R8的量很少時(shí)，ASODN被部分阻滯在上樣孔；隨著R8量的增加，ASODN的阻滯率明顯增加；當(dāng)+/-超過4∶1時(shí)，ASODN完全被阻滯，表明在該+/-時(shí)，ASODN已與R8-Lip完全結(jié)合成帶正電的復(fù)合物，停留在上樣口.

圖2 瓊脂糖凝膠電泳圖

3.3 R8-Lip的細(xì)胞毒性

圖3為R8-Lip和NLip在HepG-2，KB和A549腫瘤細(xì)胞中MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從圖3中可以看出：當(dāng)NLip為20 μg/mL時(shí)，幾乎無細(xì)胞毒性；R8-Lip在三種細(xì)胞系中毒性隨R8質(zhì)量濃度的增加而增加.當(dāng)R8的質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)，三種細(xì)胞的存活率均低于70%，這說明該質(zhì)量濃度下三種細(xì)胞均存在明顯的毒性.當(dāng)R8的質(zhì)量濃度為10 μg/mL時(shí)，HepG-2細(xì)胞的存活率超高80%，KB和A549細(xì)胞的存活率高于75%.因此，當(dāng)R8-Lip中R8的質(zhì)量濃度不超高10 μg/mL時(shí)，可用于HepG-2，KB和A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)染.

3.4 R8-Lip對ASODN細(xì)胞攝取的促進(jìn)作用

圖4為細(xì)胞攝取圖，從上到下依次是KB，HepG-2和A549；從左到右依次是NLip，R8-LiP(+/-=16∶1)和Lipfectamine 2000.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：游離的ASODN很難進(jìn)入細(xì)胞.在KB，HepG-2和A549三種細(xì)胞株中，NLip對ASODN的攝取幾乎無促進(jìn)作用.R8-Lip對ASODN細(xì)胞攝取的促進(jìn)作用與R8的質(zhì)量濃度有關(guān)，當(dāng)R8的質(zhì)量濃度由0.3 μg/mL增加到9.6 μg/mL(+/-由1∶2增加到16∶1)，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度逐漸增加(圖中未列出).當(dāng)R8-Lip/ASODN復(fù)合物中+/-=16∶1時(shí)，R8對ASODN攝取的促進(jìn)作用強(qiáng)于市售的轉(zhuǎn)染試劑Lipfectamine 2000,如圖4(a，c，e)熒光強(qiáng)度要分別高于圖4(b，d，f).

圖3 NLip和R8-Lip的細(xì)胞毒性

4 結(jié) 論

普通脂質(zhì)體表面顯電負(fù)性，ASODN負(fù)載率不高，轉(zhuǎn)染效率低，故不能直接用作ASODN的載體[11].本實(shí)驗(yàn)用R8對普通脂質(zhì)體進(jìn)行修辭，不改變其粒徑，卻能改變其電荷特性，使其具備陽離子脂質(zhì)體的特征，能夠與ASODN形成復(fù)合物.R8是一段具有膜活性的多肽，經(jīng)其修飾后的脂質(zhì)體能夠作為ASODN的載體，當(dāng)+/-=16∶1時(shí)，體外攝取效率高于市售的轉(zhuǎn)染試劑Lipfectamine 2000.R8-Lip細(xì)胞毒性具有明顯的濃度依賴性，在安全的濃度范圍內(nèi)，其促進(jìn)細(xì)胞攝取的能力依然很強(qiáng).因此，R8-Lip作為ASODN的載體，具備了高效低毒的優(yōu)勢，值得進(jìn)一步深入的研究.

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