蔡 丹， 孫姝蘭

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東植物發(fā)育生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510631)

同一朵花的雄蕊在形態(tài)、大小、顏色以及功能等方面有顯著的區(qū)別，稱為異型雄蕊[1].異型雄蕊的作用包括保護(hù)繁殖用的花粉，促進(jìn)異花授粉[2].在開花過程中，異型雄蕊也會出現(xiàn)相應(yīng)的花部運(yùn)動行為，即雄蕊向上彎曲和花絲伸長等.在對異型雄蕊運(yùn)動的適應(yīng)性意義的探究上，有學(xué)者認(rèn)為花發(fā)育過程中通過花部運(yùn)動這種行為具有實(shí)現(xiàn)延遲自交的意義[3].延遲自交是一種被廣泛報(bào)道的具有生殖適應(yīng)性的繁殖機(jī)制，其保證了植物在傳粉者稀少情況下的種子生產(chǎn),但傳粉者豐富時(shí),又允許異交優(yōu)先發(fā)生[4].雄蕊運(yùn)動指在自身能量支持下雄蕊發(fā)生的主動運(yùn)動.研究發(fā)現(xiàn)，大根槽舌蘭雄蕊的花絲能主動旋轉(zhuǎn)360°，將花藥和花粉帶到自花柱頭上實(shí)現(xiàn)自交授粉[5].在玄參科Collinsia中開花晚期雄蕊彎向柱頭的運(yùn)動，實(shí)現(xiàn)“延遲自交”，能夠達(dá)到生殖保障的目的[6].

藍(lán)豬耳是玄參科紫色翼萼屬的一年生草本植物,是研究胚囊受精的模式植物同時(shí)也是場地布置的花卉品種之一. 作者發(fā)現(xiàn)室內(nèi)培養(yǎng)的藍(lán)豬耳在自然條件下不能結(jié)實(shí); 而且開花后二長雄蕊存在伸長翻轉(zhuǎn)的運(yùn)動現(xiàn)象.

在擬南芥中花絲和花柱的伸長與生長素和赤霉素2種激素信號途徑密切相關(guān).比如在影響生長素極性運(yùn)輸?shù)碾p突變體atmdr1/atpgp1中，花絲不能正常伸長到與柱頭觸碰，無法正常進(jìn)行自花授粉[7].在抗生長素突變體axr1中，花絲不能正常伸長導(dǎo)致了突變體的育性降低[8].GA缺乏的擬南芥突變體gal-3其雌雄蕊皆變短，雄蕊過短無法進(jìn)行自交授粉[9].GAI(GA信號途徑中的一個(gè)負(fù)調(diào)控因子，屬于DELLA基因)功能獲得性突變基因在擬南芥和煙草雄蕊中的異源定位表達(dá)延遲花絲伸長引起不育[10].

本文通過施加外源GA和 NAA,探索其對藍(lán)豬耳二長雄蕊的伸長和翻轉(zhuǎn)的影響，進(jìn)一步探討內(nèi)源GA的作用. 利用PAC進(jìn)行處理，PAC是GA生物合成的抑制劑，抑制植物的生長[11-13].為了探究NAA的作用方式，利用生長素運(yùn)輸抑制劑TIBA外施處理，通過施加植物生長物質(zhì)和相關(guān)抑制劑的作用，為揭示藍(lán)豬耳二長雄蕊翻轉(zhuǎn)的生理生化機(jī)制提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

藍(lán)豬耳(ToreniafournieriLinden)種子由華南師范大學(xué)生命科學(xué)院賓金華教授惠贈.將華南師范大學(xué)生命科學(xué)院蘭花中心種植的深藍(lán)色藍(lán)豬耳植株單株收種.

種子播種在含有培養(yǎng)土(購自廣東省順德市翠藥有限公司)的小花盆中，培養(yǎng)室光周期為16 h光照/8 h黑暗，濕度70%～80%，溫度23 ℃±1 ℃，光照強(qiáng)度60 μmol/(m2·s).播種2周內(nèi)每天澆水1次；2周后，把幼苗單株移栽至含有混合土(蛙石+培養(yǎng)土)的花盆中，放在光照培養(yǎng)室中繼續(xù)種植，每2～3 d澆水1次.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 植物生長物質(zhì)和相關(guān)抑制劑的處理 隨機(jī)選取即將開放的花蕾(苞片微裂，剛見藍(lán)) 各取8～10朵為一組，共取5組，分別用GA3(20 μmol/L)、NAA(0.1 μmol/L)、PAC(20 μmol/L)和TIBA(20 μmol/L)及H2O(對照組)每3 h噴灑花蕾，開花后噴灑花朵內(nèi)的雄蕊.GA3、NAA和PAC購于Sigma公司，TIBA為廣州鼎國產(chǎn)品.

1.2.2 記錄二長雄蕊伸長和翻轉(zhuǎn)所需時(shí)間統(tǒng)計(jì) 從花朵(四瓣均展開)開放時(shí)進(jìn)行拍照，記錄開花時(shí)間，剪除翼瓣后，將數(shù)碼相機(jī)固定位置進(jìn)行每間隔 30 min側(cè)面拍照， 圖象采用photoshop軟件進(jìn)行分析.根據(jù)圖像記錄的二長雄蕊與柱頭的相對位置關(guān)系來確定伸長期和翻轉(zhuǎn)期，從開花起始至二長雄蕊的花藥與花絲基本平行，且花絲伸長變慢時(shí)(圖1 A-E)界定為伸長期，之后花藥開始快速翻轉(zhuǎn)直到完成，此時(shí)花絲基本不伸長(圖1 F-H)，界定這段時(shí)間為翻轉(zhuǎn)期，根據(jù)照片計(jì)算二長雄蕊伸長和翻轉(zhuǎn)所需時(shí)間.

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)，用T檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)豬耳在開花過程中二長雄蕊的翻轉(zhuǎn)運(yùn)動

藍(lán)豬耳初始開花時(shí)柱頭位于二長雄蕊后方，二短雄蕊與二長雄蕊以及花冠管平行，而且從高度上二長雄蕊在最上方，雌蕊柱頭位于中間，最下方則是二短雄蕊(圖1A).從花蕾完全開放到二長雄蕊翻轉(zhuǎn)前，二長雄蕊快速伸長，雄蕊進(jìn)行翻轉(zhuǎn)(圖1A-E)，在此時(shí)期，雖然雄蕊同時(shí)具備翻轉(zhuǎn)和伸長，但其長度增加較快，而且翻轉(zhuǎn)角度較小，故將此時(shí)期定為雄蕊整個(gè)翻轉(zhuǎn)過程的伸長期，平均為26 h左右.當(dāng)二長雄蕊伸長到一定長度后，雄蕊開始迅速翻轉(zhuǎn)(圖1F-H)，同時(shí)伴隨著雌蕊的伸長.當(dāng)雄蕊翻轉(zhuǎn)到雌蕊上方時(shí)，雌蕊已不再伸長，但二長雄蕊仍能繼續(xù)翻轉(zhuǎn)，長度繼續(xù)增加，等二長雄蕊的長度與角度都不發(fā)生改變時(shí)，雄蕊完成翻轉(zhuǎn)(圖1H)，這個(gè)時(shí)期，雄蕊長度增加較小，翻轉(zhuǎn)速度較快,將此時(shí)期定為翻轉(zhuǎn)期.從二長雄蕊翻轉(zhuǎn)期平均為20 h左右.

2.2 GA3促進(jìn)藍(lán)豬耳二長雄蕊翻轉(zhuǎn)運(yùn)動

GA3在藍(lán)豬耳二長雄蕊的伸長期和翻轉(zhuǎn)期起促進(jìn)作用(圖2)，使其翻轉(zhuǎn)所用總時(shí)間縮短.GA3處理后，二長雄蕊的伸長期平均用時(shí)為13.7 h，相比于對照組(26.9 h)縮短了49.1%; GA3處理的二長雄蕊的翻轉(zhuǎn)期平均用時(shí)為12.61 h，比對照組(19.42 h)顯著縮短了35.1%.說明GA3明顯促進(jìn)開花后二長雄蕊伸長和二長雄蕊翻轉(zhuǎn)的整個(gè)過程.

用GA生物合成抑制劑PAC處理藍(lán)豬耳后，其二長雄蕊伸長期平均時(shí)間為60.01 h(圖3)，明顯使伸長期比對照延長了123.1%.同時(shí)，翻轉(zhuǎn)期平均用時(shí)為51.5 h(其中處理后不再翻轉(zhuǎn)的二長雄蕊沒有計(jì)算在內(nèi))，比對照組顯著延長了165.3%.PAC明顯抑制藍(lán)豬耳開花乃至翻轉(zhuǎn)結(jié)束的整個(gè)過程.

A-E:伸長期；F-H:翻轉(zhuǎn)期

圖2 GA3促進(jìn)藍(lán)豬耳二長雄蕊翻轉(zhuǎn)的作用

Figure 2 The promotion effect of GA3on didynamous retroflexion

注：*P<0.05;**P<0.01,下圖同

圖3 PAC對藍(lán)豬耳二長雄蕊翻轉(zhuǎn)的影響

同時(shí)約有25%的藍(lán)豬耳經(jīng)PAC處理后，二長雄蕊的伸長速度慢.在雄蕊花絲發(fā)生大幅度伸長后，其花藥仍未翻轉(zhuǎn).當(dāng)花瓣開始枯萎與凋落時(shí)，其二長雄蕊始終未發(fā)生翻轉(zhuǎn).

以上結(jié)果說明內(nèi)源GA水平可能促進(jìn)二長雄蕊的伸長和翻轉(zhuǎn).

2.3 NAA對藍(lán)豬耳二長雄蕊翻轉(zhuǎn)運(yùn)動的作用

NAA處理藍(lán)豬耳使得二長雄蕊翻轉(zhuǎn)伸長期所用時(shí)間比對照組縮短了35.43%(圖4).而二長雄蕊翻轉(zhuǎn)期，NAA處理后(平均用時(shí)9.02 h)縮短該過程所用時(shí)間的53.6%，具有顯著性差異.總體來說，NAA使整個(gè)過程所用時(shí)間縮短到平均26.39 h，縮短幅度也較大，縮短為原來的57%，差異顯著.說明NAA對藍(lán)豬耳二長雄蕊的翻轉(zhuǎn)具有促進(jìn)作用.

為了進(jìn)一步了解NAA促進(jìn)藍(lán)豬耳二長雄蕊翻轉(zhuǎn)的作用，用生長素運(yùn)輸抑制劑TIBA處理藍(lán)豬耳，觀察其對雄蕊翻轉(zhuǎn)的作用.結(jié)果表明,TIBA對二長雄蕊的伸長具有抑制作用，使伸長期平均時(shí)間延長到40.95 h, TIBA使雄蕊翻轉(zhuǎn)期延長幅度達(dá)到了對照組的69.7% (圖5)，說明TIBA的作用主要集中于抑制二長雄蕊的翻轉(zhuǎn).

圖4 NAA促進(jìn)藍(lán)豬耳二長雄蕊翻轉(zhuǎn)的影響

Figure 4 The promotion effect of NAA on didynamous retroflexion

圖5 TIBA對藍(lán)豬耳二長雄蕊翻轉(zhuǎn)的影響

3 討論

有報(bào)道表明在玄參科以及其他科中存在雄蕊和雌蕊的運(yùn)動現(xiàn)象[6,14]，但是在藍(lán)豬耳中這種雄蕊伸長并花藥翻轉(zhuǎn)的現(xiàn)象未見報(bào)道.這種運(yùn)動在生物學(xué)上主要是為了促進(jìn)異交，有些物種中也為了實(shí)現(xiàn)延遲自交，在藍(lán)豬耳中通過二長雄蕊的翻轉(zhuǎn)運(yùn)動使得花藥暫時(shí)遠(yuǎn)離柱頭，推測與促進(jìn)異交有關(guān).目前，對于雌雄蕊的運(yùn)動現(xiàn)象了解較少.

赤霉素促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)展和細(xì)胞分裂，生長素也促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)展，而且生長素的不均分布促進(jìn)根莖等側(cè)向或者彎曲生長[15]，因此二長雄蕊的伸長與翻轉(zhuǎn)很有可能與這2種激素密切相關(guān). 結(jié)果表明,GA3和NAA單獨(dú)處理對藍(lán)豬耳二長雄蕊的運(yùn)動過程都起到促進(jìn)作用，但兩者促進(jìn)二長雄蕊運(yùn)動的主要作用時(shí)期有所不同.在伸長期，NAA處理后平均用時(shí)為17.37 h，而GA3處理則只需要13.7 h，相比對照處理的二長雄蕊伸長時(shí)間26.9 h，兩者之間的促進(jìn)效果有顯著差異，其中GA3對雄蕊伸長的作用較大.而在翻轉(zhuǎn)期，NAA對雄蕊花藥翻轉(zhuǎn)作用更大, NAA 與GA3影響的效果之間具有顯著性差異，說明GA3促進(jìn)翻轉(zhuǎn)可能在伸長期，而NAA促進(jìn)翻轉(zhuǎn)的主要作用在于雄蕊的翻轉(zhuǎn)期.

NAA處理明顯促進(jìn)雄蕊翻轉(zhuǎn)期，可能是內(nèi)源IAA在雄蕊翻轉(zhuǎn)部位上下兩側(cè)分布不均，外施NAA可能使上下兩側(cè)IAA含量的濃度差加大，導(dǎo)致上下兩側(cè)伸長速率差異更大，其中上面一側(cè)濃度更高生長更慢，下面一側(cè)濃度較低生長更快，表現(xiàn)為其翻轉(zhuǎn)速率也加快.與此相一致，生長素誘導(dǎo)的SAUR32/AAM1過量表達(dá)能夠下胚軸頂端彎鉤打開[16]，而SAUR63能夠促進(jìn)花絲伸長[17].TIBA處理導(dǎo)致伸長期和翻轉(zhuǎn)期都延長，其中翻轉(zhuǎn)期的延長幅度更大，說明生長素的運(yùn)輸對藍(lán)豬耳二長雄蕊的翻轉(zhuǎn)非常重要，NAA的作用可能與運(yùn)輸有關(guān).

已知PAC抑制GA的生物合成，通過阻礙貝殼杉烯向貝殼杉烯醇的氧化.經(jīng)PAC處理后的藍(lán)豬耳二長雄蕊其翻轉(zhuǎn)期延長，甚至部分材料不翻轉(zhuǎn)，說明PAC能夠抑制雄蕊的翻轉(zhuǎn).可能的原因是PAC除阻抑內(nèi)源GA的生物合成而延緩其生長外，從而達(dá)到其延緩翻轉(zhuǎn)的目的.

植物激素調(diào)控花器官的發(fā)育相互作用,如GA和生長素分別在調(diào)節(jié)細(xì)胞擴(kuò)大和組織分化兩方面有相互疊加的作用[18].同時(shí)，生長素促進(jìn)GA合成和 GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[19]，GA在發(fā)育過程中也調(diào)控生長[20].激素對雄蕊翻轉(zhuǎn)的調(diào)控不僅取決于某種激素含量變化，更重要的在于激素間平衡.對藍(lán)豬耳用外源植物生長調(diào)節(jié)劑處理，可能改變植物內(nèi)源激素間平衡，影響雄蕊翻轉(zhuǎn)的表現(xiàn).對其作用機(jī)制有待進(jìn)一步認(rèn)識，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜分析將有助于揭示其分子機(jī)制.

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