★ 韋國(guó)兵 胡奇軍 張秀秀

(江西中醫(yī)藥大學(xué) 江西 南昌 330004)

銀黃顆粒是由金銀花和黃芩兩味中藥提取精致而成,金銀花其活性成分主要為綠原酸、異綠原酸，因此銀黃顆粒具有清熱疏風(fēng)，利咽解毒的功效：可用于外感風(fēng)熱、肺胃熱盛所斂的咽干、咽痛、喉核腫大、口渴、發(fā)熱；急慢性扁桃體炎、急慢性咽炎、上呼吸道感染等的預(yù)防和治療。中國(guó)藥典通過(guò)測(cè)量其主要成分綠原酸和黃芩苷的含量，對(duì)銀黃顆粒的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)[1]。測(cè)量不確定度是表征合理地賦予被測(cè)量之值的分散性與測(cè)量結(jié)果相關(guān)聯(lián)系的參數(shù)[2]，是被測(cè)量客觀值在某一量值范圍內(nèi)的一個(gè)評(píng)定，其大小決定了測(cè)量結(jié)果的實(shí)用價(jià)值。不確定度越小，測(cè)量結(jié)果的質(zhì)量越高，使用價(jià)值越大。本文對(duì)銀黃顆粒中綠原酸的含量進(jìn)行測(cè)量，并對(duì)不確定度進(jìn)行分析，以找出影響不確定度的因素，對(duì)不確定度進(jìn)行評(píng)估，為藥物含量測(cè)定提供科學(xué)依據(jù)，并初步建立HPLC測(cè)定法的不確定度評(píng)定方式。

1 儀器與試劑

Agilent1200型高效液相色譜儀;Kromasil100-5 C18ODS2(250mm×4.6mm，5μm)型色譜柱;AB104-N(METTER)電子天平;KQ-100型超聲波清洗機(jī)(昆山超聲儀器有限公司)。

綠原酸對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(純度>99%,批號(hào)：110753-201314)，銀黃顆粒(張家界康爾佳制藥有限公司，批號(hào)20131206、20131207、20131208)，甲醇為色譜純，磷酸為優(yōu)級(jí)純，其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 銀黃顆粒中綠原酸的HPLC法含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Kromasil100-5 C18ODS2(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相：甲醇∶水∶磷酸=48∶52∶0.3，流速：1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：324nm，進(jìn)樣量：20μL，柱溫：25℃。理論塔板數(shù)以黃芩苷峰面積計(jì)算應(yīng)不得少于2500。

2.1.2 對(duì)照品的配制 取綠原酸對(duì)照品約2.0mg，精密稱定，置25mL容量瓶中，加入超純水使其溶解，用超純水定容至刻度，搖勻即得綠原酸對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取本品約0.1000g，置于100mL容量瓶中，加超純水50mL，超聲處理30min，取出，放冷，加超純水定容至刻度，搖勻。經(jīng)0.45μm的微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.1.4 測(cè)定方法

圖1 綠原酸對(duì)照品的色譜圖

圖2 銀黃顆粒的色譜圖

2.1.5 線性關(guān)系考察 精密吸取濃度分別為：0.00125，0.025，0.005，0.02，0.04mg/mL的對(duì)照品溶液20μL，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量(X)對(duì)峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=4.4215×104X+6.4611(r=0.9999)，結(jié)果表明綠原酸在0.025～0.8μg線性關(guān)系良好。

2.1.6 樣品的含量測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品溶液、與供試品溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，按外標(biāo)法(峰面積)計(jì)算，結(jié)果銀黃顆粒中綠原酸的含量為5.27mg/g,即為0.527%(n=3)。

表1 含量測(cè)定 /mg·g-1

2.1.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取綠原酸對(duì)照品溶液20μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算得綠原酸峰面積的RSD為0.59%。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將批號(hào)為20131206的樣品按“2.1.3”項(xiàng)方法制得供試品溶液，分別于制備后0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣20μL，按上述的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算得峰面積的RSD為0.65%，結(jié)果表明供試品溶液至少在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 對(duì)3個(gè)批次(批號(hào)20131206、20131207、20131208)，樣品分別進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)，每批次按上述供試品溶液的制備方法制備6份樣品，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果3個(gè)批次的綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD平均值分別為0.62%、0.98%、1.21%。

2.1.9 加樣回收實(shí)驗(yàn) 分別取三份批號(hào)為20131206的銀黃顆粒供試品5mL于10mL容量瓶中，再用0.04mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品配制80%、100%、120%的溶液，按上述色譜條件進(jìn)行色譜分析和測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，平均回收率為98.9%，RSD為2.7%。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表

2.2 數(shù)學(xué)模型 根據(jù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，建立含量測(cè)定數(shù)學(xué)模型，其中Ci為對(duì)照品的濃度，As為樣品的峰面積，Vs為樣品的體積，Ai為對(duì)照品的峰面積，ms為樣品的稱樣量。

2.3 不確定對(duì)分析 根據(jù)數(shù)學(xué)模型分析，單份供試品含量測(cè)定的不確定度主要來(lái)源于Vs，ms，Ai，As，Ci5個(gè)分量[4,5]，但是在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中mi也可以間接的通過(guò)影響Ai來(lái)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為有六個(gè)因素主要影響不確定度。經(jīng)過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)整個(gè)過(guò)程的不確定因素分析，并對(duì)上述6個(gè)因素進(jìn)行歸納，其不確定度可以歸納為4個(gè)方面：對(duì)照品峰面積的不確定度、對(duì)照品溶液濃度的不確定度、樣品峰面積的不確定度、樣品溶液濃度的不確定度[6]。每一個(gè)不確定度分量中又應(yīng)考慮每一個(gè)影響因素，直至影響因素變得足夠小，對(duì)結(jié)果的影響可以忽略時(shí)為止。圖1列出了本實(shí)驗(yàn)的所有不確定度分量的因果關(guān)系圖，有利于更直觀地分析所有的不確定度來(lái)源[7]。

圖3 不確定度分量的因果關(guān)系圖

3 不確定度分量的量化

3.2 質(zhì)量類不確定度u(mi，ms)

3.3 體積類不確定度(Vi,Vs)

3.4 峰面積類不確定度(Ai，As)

4 不確定度的合成與評(píng)定

4.1 不確定度分量匯總表 將所有的不確定度分量進(jìn)行匯總(表2)，有利于更加直觀地分析各分量的大小。

4.3 擴(kuò)展不確定度及報(bào)告不確定度 取95%的置信概率，取包含因子k=2，則綠原酸的擴(kuò)展不確定度Ur(S)=0.527%×0.14758×2=0.1556%。本次實(shí)驗(yàn)含量測(cè)定結(jié)果可表示為(5.27±0.1556)mg/g。

表3 不確定度分量匯總表

5 討論

在測(cè)量過(guò)程中，由于對(duì)照品和樣品都是一次性配置、定容好的，因此在實(shí)驗(yàn)中忽略了對(duì)照品和樣品配制過(guò)程中定容體積的重復(fù)性所引起的不確定度。由于HPLC儀本身對(duì)測(cè)定結(jié)果影響因素很多，難以對(duì)其進(jìn)行一一評(píng)估。在實(shí)際測(cè)定中，HPLC儀誤差引起的不確定度體現(xiàn)在色譜峰面積的測(cè)量結(jié)果中，所以對(duì)HPLC儀的進(jìn)樣精密度、體積流量和流量精密度等各因素的不確定度分量不作細(xì)化討論。同時(shí)對(duì)照品溶液的配制中采用超純水為溶劑，其膨脹系數(shù)相對(duì)來(lái)說(shuō)比較小一點(diǎn)，故在試驗(yàn)過(guò)程中由溫度引起的的偏差也比較小，溶液定容引入的不確定度也較小。本實(shí)驗(yàn)不確定度評(píng)估中，從表2各標(biāo)準(zhǔn)分量的不確定可以看出，本方法測(cè)量銀黃顆粒中綠原酸結(jié)果的各分量不確定度均較小，測(cè)量結(jié)果的不確定度主要來(lái)自電子天平稱量示值的不準(zhǔn)確度，對(duì)照品和樣品溶液進(jìn)樣重復(fù)性的不確定度，同時(shí)還包括供試品溶液制備的重復(fù)性不確定度等方面。在分析了上述影響測(cè)量不確定度的原因后，應(yīng)該采取相應(yīng)措施，測(cè)量結(jié)果的不確定度可以得到進(jìn)一步減小。本文所建立的方法考慮了HPLC測(cè)定過(guò)程中產(chǎn)生不確定度的大部分因素，為同類實(shí)驗(yàn)提供了有益的參考。

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