HPLC法測(cè)定竹葉提取物中葒草苷、異葒草素、牡荊素和異牡荊素的含量

★ 王暉 陳梅榮 劉良玉

(江西省藥物研究所 江西 南昌 330029)

竹葉提取物中的黃酮類成分具有抗?jié)儭⒔獐d、抗菌、抗炎、降血脂、鎮(zhèn)痛和雌性激素等生物活性和生理活性作用，而竹葉黃酮主要成分為葒草苷、異葒草素、牡荊素和異牡荊素等，為評(píng)價(jià)竹葉提取物的內(nèi)在質(zhì)量，本文對(duì)竹葉提取物中黃酮主要成分應(yīng)用高效液相色譜法進(jìn)行了定量分析，經(jīng)方法學(xué)考察，結(jié)果表明本方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀(包括SCL-10A VP控制器、LC-10AT VP泵、SPD-10A VP檢測(cè)器、SIL-10AD VP自動(dòng)進(jìn)樣器、DGU-14A脫氣機(jī)、CTO-10AS VP柱溫箱、CLASS-VP工作站)；KQ-250型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；梅特勒-托利多AE 100電子天平(梅特勒-托利多上海儀器公司)；Mettler M3電子天平(梅特勒公司)。

葒草苷對(duì)照品(購于中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111777-200801)，異葒草素對(duì)照品(購于上海同田生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：E-0160)，牡荊素對(duì)照品(購于中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111687-200602)，異牡荊素對(duì)照品(購于上海同田生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：E-0673)；竹葉提取物(自制)；乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent HC-C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-2%冰醋酸(14∶86)；流速：1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：350nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：20μL。

2.2 供試品溶液的制備 取本品，研細(xì)，取約0.2g，精密稱定，置25mL量瓶中，加甲醇超聲處理(功率：250W，頻率：40kHz)45min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取葒草苷對(duì)照品約2mg、異葒草素對(duì)照品約4mg及異牡荊素對(duì)照品約0.8mg，精密稱定，置同一5mL量瓶中；另取牡荊素對(duì)照品約1.4mg,置5mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，從中精密吸取1mL置上述5mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，從中分別精密吸取5,10,15,20,25,30μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積(A)對(duì)進(jìn)樣量(C)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 回歸方程與線性范圍

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取葒草苷、異葒草素、牡荊素與異牡荊素混合對(duì)照品溶液20μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果葒草苷RSD為0.99%，異葒草素RSD為1.12%，牡荊素RSD為1.17%，異牡荊素RSD為1.26%。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，于0,2,4,6,8h分別精密吸取20μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，結(jié)果葒草苷RSD為0.94%，異葒草素RSD為1.15%，牡荊素RSD為0.84%，異牡荊素RSD為0.85%。表明供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品6份，精密稱定，照正文中含量測(cè)定方法依法平行測(cè)定，結(jié)果葒草苷平均含量為39.17mg/g，RSD為0.97%；異葒草素平均含量為74.67mg/g，RSD為1.14%；牡荊素平均含量為10.61mg/g，RSD為1.28%；異牡荊素平均含量為24.34mg/g，RSD為0.70%。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的本品(批號(hào)：20130501)，研細(xì)，精密稱取適量，分別精密加入葒草苷對(duì)照品、異葒草素對(duì)照品、牡荊素對(duì)照品與異牡荊素對(duì)照品適量，按照2.1條件進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算評(píng)價(jià)回收率和RSD，見表2～5。

表2 葒草苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

表3 異葒草素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

表4 牡荊素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

表5 異牡荊素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

圖1 混合對(duì)照品HPLC圖譜

圖2 供試品HPLC圖譜

2.8 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取葒草苷、異葒草素、牡荊素與異牡荊素混合對(duì)照品溶液及供試品溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果在選定的色譜條件下，供試品中葒草苷、異葒草素、牡荊素、異牡荊素與其它組分分離較好。理論板數(shù)按葒草苷、異葒草素、牡荊素和異牡荊素峰計(jì)算均不低于3000。HPLC圖譜見圖1～2。

2.9 樣品測(cè)定 取樣品3批，依法測(cè)定含量，結(jié)果見表5。

表5 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 樣品前處理時(shí)，對(duì)不同溶劑提取進(jìn)行了比較試驗(yàn)，結(jié)果表明甲醇提取干擾少且提取亦完全，因此確定提取溶劑為甲醇。

3.2 經(jīng)紫外掃描，葒草苷、異葒草素、牡荊素與異牡荊素均在350nm左右有最大吸收，因此選擇350nm作為本品檢測(cè)波長(zhǎng)。

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