員榮，孫麗麗，楊立偉*

(1.廣東藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東省食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510180)

·中藥工業(yè)·

一測(cè)雙評(píng)法測(cè)定咳特靈膠囊中牡荊苷與異牡荊苷的含量△

員榮1，2，孫麗麗2，楊立偉2*

(1.廣東藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東省食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510180)

目的：建立咳特靈膠囊一測(cè)雙評(píng)法，并進(jìn)行方法學(xué)考察。方法：以牡荊苷為研究對(duì)象，建立牡荊苷與異牡荊苷的相對(duì)校正因子(RCF)，并利用校正因子對(duì)異牡荊苷進(jìn)行含量測(cè)定，實(shí)現(xiàn)一測(cè)雙評(píng)；采用外標(biāo)法測(cè)定牡荊苷與異牡荊苷的含量，比較計(jì)算值與實(shí)測(cè)值間的差異。結(jié)果：在一定線性范圍內(nèi)，牡荊苷與異牡荊苷的RCF為0.9，不同廠家的咳特靈膠囊中兩個(gè)成分的計(jì)算值與實(shí)測(cè)值無(wú)明顯差異。結(jié)論：本研究建立的一測(cè)雙評(píng)法準(zhǔn)確、可行，可為中藥制劑多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)提供新思路。

一測(cè)雙評(píng)；校正因子；高效液相色譜；牡荊苷；異牡荊苷

咳特靈膠囊現(xiàn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》第十四冊(cè)，小葉榕干浸膏為本品的主要成分之一，其為桑科植物細(xì)葉榕FicusmicrocarpaL.f.的干燥葉加工制成的提取物。房志堅(jiān)等[1]對(duì)小葉榕葉的水提物進(jìn)行研究，結(jié)果表明小葉榕葉中含有牡荊苷和異牡荊苷等黃酮類化合物；李彥文[2]對(duì)小葉榕進(jìn)行化學(xué)成分研究，結(jié)果表明小葉榕中含有牡荊苷和異牡荊苷?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明：牡荊苷和異牡荊苷對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑制作用，有中等的抗副流感病毒(Para 3)活性[3]。因此，測(cè)定牡荊苷和異牡荊苷的含量對(duì)于控制咳特靈膠囊質(zhì)量具有重要意義。但異牡荊苷對(duì)照品價(jià)格昂貴且來(lái)源有限，因此本研究采用一測(cè)雙評(píng)法[4]測(cè)定其藥效成分，確定牡荊苷與異牡荊苷的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系，實(shí)現(xiàn)用一個(gè)對(duì)照品同步測(cè)定兩個(gè)藥效成分的含量[5]。一測(cè)多評(píng)理念提出之后，許多實(shí)驗(yàn)室及研究機(jī)構(gòu)對(duì)此法在藥材及制劑中的應(yīng)用進(jìn)行研究。目前，以一測(cè)多評(píng)法測(cè)定黃連中目標(biāo)成分的含量已收載入《中華人民共和國(guó)藥典》，但此法在中藥制劑中的應(yīng)用尚未有品種收載。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AT高效液相色譜儀系統(tǒng)(LC-20AT泵、CTO-15C柱溫箱、SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD-M20Ae二極陣列管檢測(cè)器)；KQ-300DA超聲波提取器(昆山市超聲儀器有限公司)；純水儀(美國(guó)Millipore公司)；AG135、AEG-120G型電子天平(德國(guó)AEG工業(yè)技術(shù)公司)。

1.2 試藥

牡荊苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111687-220501)；異牡荊苷對(duì)照品(供含量測(cè)定用，含量≥98%，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：YM0506HA14)。

咳特靈膠囊由廣東一力集團(tuán)制藥公司、廣州白云山制藥股份有限公司、廣州白云山制藥總廠、廣東一力羅定制藥有限公司、廣州市花城制藥廠提供。見(jiàn)表1。

表1 收集樣品情況

2 方法與結(jié)果

2.1 一測(cè)雙評(píng)方法學(xué)考察

2.1.1 供試品溶液的制備 取咳特靈膠囊(批號(hào)：5140303)10粒，精密稱定，研細(xì)，取1.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密量取牡荊苷、異牡荊苷對(duì)照品適量，用70%甲醇溶液配成質(zhì)量濃度分別為10.61、14.40 μg·mL-1的牡荊苷和異牡荊苷對(duì)照品溶液。

2.1.3 陰性對(duì)照品溶液的制備 取小葉榕干浸膏陰性樣品1.4 g，照供試品溶液的制備方法，制成陰性對(duì)照溶液。

2.1.4 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇為流動(dòng)相A，0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按表2進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為335 nm；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。理論板數(shù)按牡荊苷峰計(jì)算應(yīng)不得低于3000。在上述色譜條件下，各組分分離度較好，見(jiàn)圖1。

表2 擬定的流動(dòng)相梯度表

A.對(duì)照品；B.樣品；C.陰性對(duì)照品；1．牡荊苷；2.異牡荊苷。圖1 咳特靈膠囊樣品及對(duì)照品色譜圖

2.1.5 線性考察 精密稱取牡荊苷對(duì)照品8.31 mg，置100 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度為0.083 1 mg·mL-1的牡荊苷儲(chǔ)備液；精密稱取異牡荊苷對(duì)照品8.40 mg，置100 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度為0.084 0 mg·mL-1的異牡荊苷儲(chǔ)備液。取上述牡荊苷、異牡荊苷對(duì)照品儲(chǔ)備液各2 mL，加入25 mL容量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度分別為0.006 648、0.006 720 mg·mL-1的牡荊苷、異牡荊苷混合對(duì)照品溶液。分別進(jìn)樣5、10、40、60、100 μL。分別以牡荊苷和異牡荊苷濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程，異牡荊苷：Y=2.783×107X-1800，r=0.999 6；牡荊苷：Y=2.573×107X-1.176×105，r=0.999 8，結(jié)果表明牡荊苷和異牡荊苷分別在0.033 2～0.636 6 μg和0.033 6～0.672 0 μg線性關(guān)系良好。

2.1.6 校正因子的計(jì)算 以牡荊苷為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算牡荊苷對(duì)異牡荊苷的相對(duì)校正因子，計(jì)算公式：

式中A為組分峰面積，C為組分濃度，i為內(nèi)標(biāo)物，S為其他組分，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 相對(duì)校正因子的計(jì)算

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品(批號(hào)：5140303)，精密稱取6份，按擬定方法測(cè)定，結(jié)果表明牡荊苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.260 3 mg·g-1，RSD為1.5%；異牡荊苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.580 8 mg·g-1，RSD為2.3%，說(shuō)明本方法的重復(fù)性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性 精密吸取同一供試品(批號(hào)：5140303)溶液，分別在1、3、6、9、12、16、24 h，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。結(jié)果牡荊苷峰面積的RSD為2.0%，異牡荊苷峰面積的RSD為2.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.9 回收率考察 分別取已測(cè)得含量的供試品(批號(hào)：5140303，牡荊苷0.260 3 mg·g-1，異牡荊苷：0.580 8 mg·g-1)0.4、0.7、1.4 g各4份，精密稱定，分別加入2.1.2項(xiàng)下的牡荊苷對(duì)照品儲(chǔ)備液1、1.5、3 mL和異牡荊苷對(duì)照品溶液2、3、6 mL，按2.1.1項(xiàng)下方法制備溶液，按擬定的方法進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰峰面積并計(jì)算回收率，結(jié)果表明，本方法對(duì)牡荊苷及異牡荊苷含量測(cè)定準(zhǔn)確性較好。詳見(jiàn)表4～5。

表4 牡荊苷回收率結(jié)果

表5 異牡荊苷回收率結(jié)果

2.2 校正因子重現(xiàn)性考察

2.2.1 色譜柱及高效液相色譜儀考察 取2.1.5項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣5、10、40、60、100 μL，按2.1.6項(xiàng)下方法計(jì)算異牡荊苷的相對(duì)校正因子。

本試驗(yàn)考察了Waters 2695、島津LC-2010A HT兩種高效液相色譜儀和Welch XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Purospher STAR RP-18 endcapped(250 mm×4.6 mm，5μm)、Sepox Bio-C-18(250 mm×4.6 mm，5 μm)3種色譜柱，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 不同儀器及色譜柱的相對(duì)校正因子比較

2.2.2 實(shí)驗(yàn)室考察 采用一測(cè)雙評(píng)法，經(jīng)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行復(fù)核試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室1所得結(jié)果為0.893，實(shí)驗(yàn)室2所得結(jié)果為0.905。

2.2.3 待測(cè)組分色譜峰定位 利用相對(duì)保留時(shí)間定位，分別考察了不同柱溫、不同色譜柱及不同儀器等條件下，異牡荊苷峰相對(duì)于牡荊苷峰的保留時(shí)間。結(jié)果表明，在以上不同條件下，保留時(shí)間比較穩(wěn)定，說(shuō)明以相對(duì)保留時(shí)間定位是可行的，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 相對(duì)保留時(shí)間的考察

2.3 一測(cè)雙評(píng)法與外標(biāo)法結(jié)果比較

對(duì)收集的24批樣品分別按照外標(biāo)法和一測(cè)雙評(píng)法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果異牡荊苷的含量結(jié)果相對(duì)偏差均不超過(guò)2.2%。說(shuō)明本研究選擇Rf異/牡為0.90是合理的，對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響不大，見(jiàn)表8。

表8 兩種方法測(cè)定異牡荊苷的比較

2.4 含量測(cè)定

按擬定的含量測(cè)定方法對(duì)收集的5個(gè)生產(chǎn)廠家24批樣品分別進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表9。24批樣品中牡荊苷和異牡荊苷含量之和的均值為0.837 mg·g-1。

2.5 限度制訂

所測(cè)的24批樣品中牡荊苷和異牡荊苷含量之和的均值為0.837 mg·g-1，即0.42 mg/粒(每粒膠囊0.5 g，分別稱取20粒，記錄其各自總重量，然后取出內(nèi)容物，再稱量膠囊殼的重量，然后計(jì)算每粒的凈重量，并求得平均值)。由于小葉榕藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)牡荊苷和異牡荊苷含量測(cè)定項(xiàng)，故擬定本品含量測(cè)定限度以所收集到的樣品測(cè)定結(jié)果的平均值(0.42 mg/粒)為依據(jù)。考慮到藥材來(lái)源及大生產(chǎn)等可能產(chǎn)生的差異，筆者將所測(cè)定結(jié)果的平均值下調(diào)30%，擬定本品限度。咳特靈膠囊含小葉榕浸膏，以牡荊苷(C21H20O10)和異牡荊苷(C21H20O10)的總量計(jì)，不得少于0.28 mg/粒。

表9 供試品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1本試驗(yàn)比較了不同提取溶劑、提取方式、提取時(shí)間、溶劑用量等，最后確定以70%甲醇25 mL超聲30 min，此條件下提取較為完全，且方法簡(jiǎn)便。

3.2牡荊苷與異牡荊苷均為咳特靈膠囊的藥效成分，異牡荊苷價(jià)格昂貴，較難得到，且牡荊苷與異牡荊苷為同分異構(gòu)體，因此以牡荊苷為內(nèi)參物計(jì)算異牡荊苷的含量是合理的。

3.3 創(chuàng)新點(diǎn)

在進(jìn)行一測(cè)雙評(píng)研究時(shí)，筆者建議盡量使各物質(zhì)的濃度一致，以減少各對(duì)照品濃度不一致造成的誤差。本研究，配成濃度比為1∶1的混合對(duì)照品，在保證兩者濃度相同的情況下，相對(duì)校正因子仍與理論值1差別較大，因此，相對(duì)校正因子與物質(zhì)結(jié)構(gòu)的關(guān)系有待進(jìn)一步研究；同時(shí)建議在進(jìn)行一測(cè)多評(píng)計(jì)算相對(duì)校正因子時(shí)，將各對(duì)照品的濃度比配成1，此項(xiàng)建議并未見(jiàn)此領(lǐng)域研究者提出。

3.4對(duì)于藥物的整體質(zhì)量評(píng)價(jià)，多采用指紋圖譜法，而一測(cè)雙評(píng)法是在藥效成分明確基礎(chǔ)上的定量分析。目前，一測(cè)雙評(píng)法多用于藥材中藥效成分的研究，已有很多文獻(xiàn)報(bào)道在其中藥制劑中的應(yīng)用，《中華人民共和國(guó)藥典》中尚無(wú)關(guān)于中藥成藥的記載。

[1] 房志堅(jiān)，戴臻，李書淵.小葉榕葉HPLC指紋圖譜的研究[J].中藥材，2008(10)：31-35.

[2] 李彥文.小葉榕化學(xué)成分和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2008.

[3] 張雪，徐道華.牡荊苷的藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013(35)：35-38.

[4] 王智民，錢忠直，張啟偉，等.一測(cè)多評(píng)法建立的技術(shù)指南[J].中國(guó)中藥雜志，2011(6)：657-658.

[5] 陳建偉，李祥，步達(dá)，等.一測(cè)多評(píng)法及其在中藥材質(zhì)量控制中的應(yīng)用[C].//中華中醫(yī)學(xué)會(huì)中藥分析分會(huì)第五屆學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集.沈陽(yáng)：中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)中藥分析分會(huì)，2012：20-23.

SimultaneousDeterminationofVitexinandIsovitexinofKetelingCapsulesbyDouble-ComponentsAssaywithSingleMarker

YUANRong1，2，SUNLili2，YANGLiwei2*

(1.GuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou510006，China；2.GuangdongInstituteforFoodandDrugControl，Guangzhou510180，China)

Objective：To establish a quantitative assay of double-components by single-marker for determination of two components in Keteling capsules and and conduct the method validation test.Methods：Vitexin was selected as an internal reference substance，RCF of isovitexin was calculated.The contents of two components were determined by both external standard method and Double-Components Assay by Single Marker.The validity of the QAMS method was evaluated by comparison of their quantitative results of both methods.Results：RCF of isovitexin with reference to vitexin were 0.90 and the quantitative results of both external standard method and QAMS had no significant difference.Conclusion：The established method is accurate and feasible，and can provide a new mind for the quality assess of preparation of Chinese traditional medicine.

QAMS；RCF；HPLC；Vitexin；Isovitexin

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.6.018

2014-11-26)

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81102146)

*

楊立偉，主任藥師，博士，研究方向：中藥質(zhì)量控制與快速檢測(cè)；E-mail：yangliwei33@aliyun.com