HPLC法測定桔梗藥材中桔梗皂苷D的含量

★ 洪瑋 羅娟敏 郭磊 樊海燕 索衛(wèi)國 黃衛(wèi)東 蔡繼寶

(江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)研發(fā)中心 南昌 330096)

桔梗為桔?？浦参锝酃latycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.的干燥根，其味苦、辛，性平，歸肺經(jīng)，有開宣肺氣，祛痰排膿之功效[1]。臨床上用于治療咳嗽痰多，胸悶不暢，咽痛，音啞，肺癰吐痰，瘡瘍膿成不潰等癥[2]。主要化學(xué)成分為齊墩果酸型五環(huán)三萜皂苷，桔梗皂苷A、桔梗皂苷B、桔梗皂苷D[3]等，其他尚含有黃酮、聚炔、甾體、酚酸、脂肪酸等類型的化合物?，F(xiàn)代研究表明，桔梗的主要活性成分為桔梗皂苷類成分，具有祛痰、抗炎、降低毛細(xì)血管通透性、抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎[4]、以及松弛腸道平滑肌、抗腫瘤[5]等多方面的生物活性。本實驗通過HPLC建立了桔梗中桔梗皂苷D含量測定的方法。

1 材料與儀器

Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)，配DAD檢測器(Agilent公司，美國)，Milli-Q超純水儀(Millipore公司，美國)、Phenomenex Luna C18色譜柱、BSA124S天平(Sartorius)。

乙腈(色譜純，TEDIA)、磷酸(分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司)、超純水、桔梗皂苷D標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所111851-201204)、桔梗標(biāo)準(zhǔn)藥材(中國藥品生物制品檢定所121028-201210)、桔梗藥材分別購于某市的各大藥店及藥材市場，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)張文惠教授鑒定均為桔梗藥材。

2 實驗方法

2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Luna C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相A：0.1%磷酸溶液，流動相B：乙腈，按表1進(jìn)行梯度洗脫；流速：0.5mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量10μL；檢測波長為210nm。

表1 梯度洗脫程序

2.2 供試品溶液的制備 精密稱定干燥桔梗粉末(過三號篩)適量，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇30mL，超聲30min，濾過；濾渣置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇30mL，超聲30min，濾過；合并續(xù)濾液，于水浴中蒸干至50mL以下，用甲醇定容至50mL，續(xù)濾液過0.22μm微孔濾膜，備用。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取桔梗皂苷D對照品適量，用甲醇溶解并稀釋成0.24mg/mL的溶液，即得。

2.4 線性關(guān)系的考察 分別量取對照品儲備液5，2，1，0.5mL，分置10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.22μm微孔濾膜濾過；精密吸取上述溶液及儲備液各10L注入色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積(Y)對溶液濃度(X)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明桔梗皂苷D在0.06-2.4μg范圍內(nèi)，峰面積具有良好的線性關(guān)系，其回歸方程為：Y=2984X-3.5993，r=0.9999色譜圖見圖1-2。

圖1 桔梗皂苷D對照品的色譜圖

圖2 桔梗提取液的色譜圖

2.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10μL，在2.1項色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，得到桔梗皂苷D的峰面積，其RSD為0.42%，表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，在2.1項色譜條件下，分別在0，3，6，9，12，24h記錄桔梗皂苷D的峰面積，其RSD為0.62%，說明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批樣品5份，置具塞錐形瓶中，精密稱定，按2.2項供試品溶液的制備方法下制備，在2.1項色譜條件下測定，樣品中桔梗皂苷D的平均含量為2.089mg/g，RSD為3.46%，表明方法的重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收試驗 精密稱取已知含量的同一批樣品6份，置具塞錐形瓶中，加入一定量的對照品，按2.2項供試品溶液的制備方法制備樣品，依照2.1項色譜條件測定，桔梗皂苷D的平均回收率為100.09%，RSD為1.73%，結(jié)果見表5。

表5 桔梗皂苷D的加樣回收試驗結(jié)果

3 結(jié)果

分別測定了13個桔梗藥材樣品中桔梗皂苷D的含量，結(jié)果見表6。

表6 13個桔梗藥材樣品中桔梗皂苷D的含量

4 討論

4.1 考察了不同提取方法(超聲提取、加熱回流提取、索式提取)對桔梗皂苷D提取率的影響，結(jié)果表明，超聲提取與加熱回流提取的桔梗皂苷D的含量相當(dāng)，且大于索氏提取得到的量，由于超聲方法比較簡便，因此采用超聲提取作為桔梗皂苷D的提取工藝。

4.2 考察了不同提取溶劑(水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇)對桔梗皂苷D提取率的影響，結(jié)果表明，以50%和75%甲醇溶液作為提取溶劑所制得的桔梗皂苷D含量最高且相當(dāng)，但使用50%甲醇溶液更經(jīng)濟(jì)，因此本實驗選定甲醇含量為50%。

4.3 考察了不同溶劑用量(20、30、50、65mL)對桔梗皂苷D提取率的影響，結(jié)果表明，溶劑用量為20mL得到的桔梗皂苷D含量較少，溶劑用量為30、50、65mL得到的桔梗皂苷D含量相差不大，因此選定溶劑用量為30mL。

4.4 考察了不同提取時間(20、30、40、50min)對桔梗皂苷D提取率的影響，結(jié)果表明，超聲20min得到的桔梗皂苷D含量較少，超聲30、40、50min得到的桔梗皂苷D含量相差不大，因此選定超聲時間為30min。

4.5 考察了不同提取次數(shù)(1次、2次、3次)對桔梗皂苷D提取率的影響，結(jié)果表明，初次提取的桔梗皂苷D含量為4.01mg/g，第二次提取后桔梗皂苷D的含量占2次總含量的13.20%，第三次桔梗皂苷D的含量占3次總含量的3.55%，因此，采用二次可基本提取完，本實驗選擇二次超聲提取。

4.6 實驗結(jié)果表明，所收集的桔梗藥材均符合2010版中國藥典桔梗項下以桔梗皂苷D(C57H92O28)計不得少于0.1%的規(guī)定。本法建立的測定桔梗中桔梗皂苷D含量的方法簡便，重復(fù)性好，可用于桔梗藥材的質(zhì)量評價。

[1]國家藥典委員會.中國藥典2010年版一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:259-260.

[2]武博,劉萍.桔梗的現(xiàn)代研究進(jìn)展[J].中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測,2008,05(2):48-50.

[3]郭文杰,許旭東,魏建和,等.桔梗中三萜皂苷類化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].中國藥學(xué)雜志,2008,43(11):801-804.

[4]吳文君,單提昆,何嘉凝,等.桔梗皂苷化學(xué)結(jié)構(gòu)及藥理研究進(jìn)展[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報,2012,33(3):176-178.

[5]尹若熙,俞騰飛,李中燕,等.桔梗的藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥科學(xué),2012,02(19):36-37,62.