張繼新，龐志剛，劉 超，劉新江，尚 闖，耿 翔

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科 鄭州 450014

阿霉素、5-氟尿嘧啶聯(lián)合熱療對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖及凋亡的影響

張繼新，龐志剛#，劉 超，劉新江，尚 闖，耿 翔

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科 鄭州 450014

#通訊作者，男，1963年7月生，碩士，主任醫(yī)師，教授，研究方向：原發(fā)性肝癌，E-mail：pzg63726@sina.com

阿霉素；5-氟尿嘧啶；熱療；熱化療；SMMC-7721細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

目的：探討阿霉素(ADM)、5-氟尿嘧啶(5-FU)聯(lián)合熱療對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法SMMC-7721細(xì)胞分為對(duì)照組、單純熱療組、5-FU+ADM組、ADM+熱療組、5-FU+熱療組、5-FU+ADM+熱療組，各組熱處理均為43 ℃水浴1 h再37 ℃培養(yǎng)23 h。各組處理24 h后采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖，計(jì)算增殖抑制率，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，計(jì)算凋亡率。結(jié)果5-FU+ADM+熱療組細(xì)胞增殖抑制率高于單純熱療組、5-FU+ADM組、ADM+熱療組、5-FU+熱療組[(74.66±1.61)%vs(19.76±1.41)%、(55.04±1.89)%、(40.21±2.27)%、(35.56±2.24)%，(F=76.843,P<0.001)]。5-FU+ADM+熱療組的細(xì)胞凋亡率高于單純熱療組、5-FU+ADM組、ADM+熱療組、5-FU+熱療組[(80.13±2.42)%vs(28.38±1.92)%、(65.40±2.05)%、(49.32±1.76)%、(45.99±1.70)%，(F=230.506,P<0.001)]。結(jié)論加熱能增強(qiáng)5-FU聯(lián)合ADM化療對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，其效應(yīng)優(yōu)于單純熱療或ADM與5-FU聯(lián)合以及單純化療聯(lián)合熱療。

肝癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。該病起病隱匿、發(fā)展較快，侵襲性強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高、治療較難，目前尚缺乏有效的治療藥物，因此尋找安全有效的治療方法已成為目前研究的重點(diǎn)。腫瘤熱療有“綠色療法”之稱(chēng)[1]。研究[2-3]已證實(shí)，熱療能顯著提高腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性及化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，但現(xiàn)有研究?jī)H限于單種化療藥物聯(lián)合熱療。已有文獻(xiàn)[4-5]報(bào)道化療藥物聯(lián)合熱療對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用明顯高于單獨(dú)化療。阿霉素(adriamycin,ADM)與5-氟尿嘧啶(5-FU)是臨床常用化療藥物。作者觀察了ADM與5-FU聯(lián)合化療再結(jié)合熱療對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖及凋亡的影響，為肝癌的臨床治療提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1材料SMMC-7721細(xì)胞株由河南省腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供；注射用鹽酸ADM(輝瑞制藥有限公司產(chǎn)品)，5-FU(美國(guó)Sigma公司),四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，美國(guó)Sigma公司), 二甲基亞砜(DMSO，美國(guó)Sigma公司), AnnexinV/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(聯(lián)科生物公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和分組將SMMC-7721細(xì)胞置于配制好的含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、濕度80%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d換液1次，2～3 d傳代。實(shí)驗(yàn)分組及處理方法：實(shí)驗(yàn)設(shè)6組，每組6個(gè)復(fù)孔，獨(dú)立重復(fù)3次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞，經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞密度至3×104mL-1，接種于96孔板中，每孔內(nèi)加150 μL細(xì)胞懸液。①對(duì)照組：加入細(xì)胞懸液及50 μL培養(yǎng)液，不加任何藥物?？瞻讓?duì)照僅加入培養(yǎng)液，用于機(jī)器調(diào)零。②單純熱療組：加50 μL培養(yǎng)液置于43 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，熱處理后繼續(xù)置入培養(yǎng)體系(37 ℃，下同)中培養(yǎng)23 h。③5-FU+ADM組：加入含0.25 g/L 5-FU及1 mg/L ADM的培養(yǎng)液共50 μL，于培養(yǎng)體系中培養(yǎng)24 h。④ADM+熱療組：加入50 μL含1 mg/L ADM的培養(yǎng)液，置于43 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后繼續(xù)置入培養(yǎng)體系中培養(yǎng)23 h。⑤5-FU+熱療組：加50 μL含0.25 g/L 5-FU的培養(yǎng)液，置于43 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后繼續(xù)置入培養(yǎng)體系中培養(yǎng)23 h。⑥5-FU+ADM+熱療組：加入50 μL含0.25 g/L 5-FU及1 mg/L ADM的培養(yǎng)液后，置于43 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后繼續(xù)置入培養(yǎng)體系中培養(yǎng)23 h。

1.3細(xì)胞增殖抑制率測(cè)定細(xì)胞按1.2中分組處理，各組最終容積為200 μL。每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，棄上清液，加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min；檢測(cè)490 nm處各孔的吸光度(A)值，計(jì)算增殖抑制率。增殖抑制率=[(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值]×100%。采用協(xié)同作用q值[6]判斷化療與熱療聯(lián)合應(yīng)用的性質(zhì)。q=E(CD)/(EC+ED-EC×ED),式中E(CD)為ADM與5-FU聯(lián)合熱療的增殖抑制率, EC為單純熱療組的增殖抑制率，ED為ADM和5-FU聯(lián)合化療的增殖抑制率。q<0.85示兩者有拮抗作用，0.85≤q≤1.15示兩者有相加作用，q>1.15示兩者有協(xié)同作用。

1.4細(xì)胞凋亡檢測(cè)細(xì)胞按1.2中分組處理后，每組收集5×105個(gè)細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后移入10 mL離心管中，1 000 r/min離心10 min；棄上清液，加入PBS液，1 000 r/min離心10 min，前后共離心、洗滌細(xì)胞2次；向洗滌后的細(xì)胞中加入1 mL Binding buffer，然后加入10 μL AnnexinV/FITC和5 μL PI。輕輕混勻，在室溫避光條件下反應(yīng)15 min。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞，計(jì)算凋亡率。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。各組間細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率比較見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率與凋亡率比較(n=3) %

*:與5-FU+ADM+熱療組比較，P<0.01。

2.2協(xié)同作用熱療與ADM及5-FU聯(lián)合應(yīng)用時(shí)在抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖中的q值為1.17。

3 討論

熱療為一種新的腫瘤治療方法，被稱(chēng)為繼手術(shù)、化療、放療和生物治療之后的第5種腫瘤治療模式[7]。人體正常細(xì)胞和癌細(xì)胞對(duì)熱的耐受性和敏感性存在明顯差異[8-9]。熱療對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用取決于溫度和時(shí)間，藥物對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用具有時(shí)間依賴(lài)性。已證明[10]，42～43 ℃對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力最強(qiáng)。有研究[11]表明43 ℃藥物作用60 min時(shí)對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷作用已接近最大。也有研究[12]表明全身治療的恒溫期治療時(shí)間為1 h。Nikfarjam等[13]對(duì)肝癌細(xì)胞加熱后發(fā)現(xiàn)，其細(xì)胞凋亡可持續(xù)96 h，并在24 h達(dá)到高峰。結(jié)合臨床實(shí)際情況及患者的耐受性，該實(shí)驗(yàn)以溫度43 ℃ 60 min后繼續(xù)培養(yǎng)23 h為熱療條件。

5-FU目前仍是肝癌化療的首選藥物，可阻滯G1期細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)化的進(jìn)程，而熱療與5-FU聯(lián)合應(yīng)用既能抑制細(xì)胞周期G1的進(jìn)程又能抑制S期細(xì)胞，從而使G2/M期細(xì)胞增多，而G2/M期細(xì)胞增多是細(xì)胞損傷的普遍反應(yīng)[14]。ADM是腫瘤細(xì)胞有絲分裂S期非特異性阻滯藥物，主要作用機(jī)制是在DNA合成過(guò)程中誘導(dǎo)TOPOⅡ抑制劑-DNA斷裂物復(fù)合物的形成，引起細(xì)胞死亡或停滯于S期、G2期[15-16]。熱療與化療協(xié)同作用的機(jī)制在于：化療對(duì)富氧細(xì)胞的敏感性高于乏氧細(xì)胞，熱療對(duì)乏氧細(xì)胞的敏感性高于富氧細(xì)胞，因此化療配合熱療既可殺滅富氧細(xì)胞又能殺滅乏氧細(xì)胞；熱療可使細(xì)胞膜蛋白變性、細(xì)胞膜穩(wěn)定性破壞、通透性升高、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙、呼吸抑制、酸中毒，從而使化療藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的量增多，增加了細(xì)胞毒作用，加強(qiáng)了化療效果[17]；熱療還可增加血供，促進(jìn)化療藥物局部積聚攝取和加快反應(yīng)速度；熱化療共同促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生[18]；熱化療可增加對(duì)癌細(xì)胞的殺傷，并降低癌細(xì)胞的多種藥物抗藥性[19]。

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，熱療聯(lián)合兩種化療藥物可以顯著提高人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制率及凋亡率，且效果較單純熱療、兩種化療藥物聯(lián)合及單種化療藥物聯(lián)合熱療好。熱療和化療聯(lián)合有很好的互補(bǔ)性，但我國(guó)腫瘤熱療研究尚處于初級(jí)階段。如何把當(dāng)前熱療方法與化療相結(jié)合，根據(jù)腫瘤細(xì)胞的種類(lèi)及生物學(xué)特性選擇最合適的化療聯(lián)合方案、最佳的熱療溫度及時(shí)間以及熱療和化療應(yīng)用的先后順序及間隔時(shí)間，仍是下一步研究的重點(diǎn)。

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(2013-10-20收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Effect of adriamycin and 5-fluorouracil combined with hyperthermia on proliferation and apoptosis of SMMC-7721 cells

ZHANGJixin,PANGZhigang,LIUChao,LIUXinjiang,SHANGChuang，GENGXiang

DepartmentofGeneralSurgery，theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

adriamycin;5-fluorouracil;hyperthermia;thermo-chemotherapy;SMMC-7721 cell;cell proliferation;cell apoptosis

Aim: To study the effect of adriamycin(ADM) and 5-fluorouracil(5-FU) combined with hyperthermia on proliferation and apoptosis of SMMC-7721 cells. Methods: SMMC-7721 cells were allocated into 6 groups：control group，pure hyperthermia group, 5-FU+ADM group, ADM+hyperthermia group, 5-FU+hyperthermia group, 5-FU+ADM+hyperthermia group. The cell proliferation inhibition effect was evaluated by MTT assay.The apoptosis of SMMC-7721 cells were determined by flow cytometry. Results: The cell proliferation inhibition rate of 5-FU+ADM+hyperthermia group was higher than those of pure hyperthermia group, 5-FU+ADM group, ADM+hyperthermia group, 5-FU+hyperthermia group[(74.66±1.61)%vs(19.76±1.41)%,(55.04±1.89)%,(40.21±2.27)%,(35.56±2.24)%，(F=76.843,P<0.001)]; the apoptosis rate of 5-FU+ADM+hyperthermia group was higher than those of pure hyperthermia group, 5-FU+ADM group, ADM+hyperthermia group, 5-FU+hyperthermia group[(80.13±2.42)%vs(28.38±1.92)%,(65.40±2.05)%,(49.32±1.76)%,(45.99±1.70)%，(F=230.506,P<0.001)].Conclusion: ADM and 5-FU combined with hyperthermia can increase the inhibition effect on proliferation and induce apoptosis of SMMC-7721 cells compared with pure hyperthermia, or ADM and 5-FU combination or single chemotherapy combined with hyperthermia.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.020

R735.7