吳昌義，林瑞慶，何勇，劉國(guó)華

(1.重慶市璧山縣畜牧獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)中心，重慶 璧山 402760；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642；3.新鄉(xiāng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

人蛔蟲(chóng)和豬蛔蟲(chóng)線粒體nad5基因的序列分析

吳昌義1，林瑞慶2，何勇3，劉國(guó)華4*

(1.重慶市璧山縣畜牧獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)中心，重慶 璧山 402760；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642；3.新鄉(xiāng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

以采自中國(guó)不同地方的人蛔蟲(chóng)與豬蛔蟲(chóng)為研究對(duì)象，PCR擴(kuò)增其線粒體煙酰胺脫氫酶亞基Ⅴ基因(nad5)的部分序列(pnad5)并進(jìn)行序列測(cè)定，應(yīng)用ClustalX 1.81程序?qū)π蛄羞M(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示：所獲得的pnad5序列長(zhǎng)度一致，均為556 bp；人蛔蟲(chóng)和豬蛔蟲(chóng)的pnad5序列差異僅為0.0%～2.6%，本研究結(jié)果支持人蛔蟲(chóng)與豬蛔蟲(chóng)是同一個(gè)種的結(jié)論。

人蛔蟲(chóng)；豬蛔蟲(chóng)；線粒體DNA；煙酰胺脫氫酶亞基Ⅴ基因(nad5)；序列分析

許多后生動(dòng)物擁有緊湊的環(huán)形的線粒體基因組，大約14～20 kb。線粒體DNA(mtDNA)具有分子較小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、進(jìn)化速度快、基因間不發(fā)生重組和母性遺傳等特點(diǎn)，非常適合用于群體遺傳學(xué)和生物進(jìn)化學(xué)研究[7]。mtDNA作為一種可靠的遺傳標(biāo)記，已被廣泛應(yīng)用于寄生蟲(chóng)的種類鑒定及種系發(fā)育研究[8–12]。本研究利用來(lái)自中國(guó)3個(gè)省的人蛔蟲(chóng)和中國(guó)廣東4個(gè)不同地方的豬蛔蟲(chóng)，分析其線粒體煙酰胺脫氫酶亞基Ⅴ基因(nad5)的部分序列的特征，旨在為判斷人蛔蟲(chóng)與豬蛔蟲(chóng)是否為同一個(gè)種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲(chóng)體來(lái)源

3個(gè)人蛔蟲(chóng)蟲(chóng)體分別來(lái)自中國(guó)山東、寧夏、廣東湛江；12個(gè)豬蛔蟲(chóng)蟲(chóng)體分別來(lái)自廣東廣州(5個(gè))、深圳(4個(gè))、湛江(2個(gè))、陽(yáng)江(1個(gè))，詳見(jiàn)表1。

表1 本研究所用的人蛔蟲(chóng)及豬蛔蟲(chóng)樣品及其nad5序列的GenBank登錄號(hào)Table 1 Geographical origins of Ascaris samples and their GenBank accession numbers for sequences of nad5 gene

1.2 主要試劑

DNA抽提試劑盒 Wizard DNA Clean–up System為Promega公司產(chǎn)品；蛋白酶K為Merk公司產(chǎn)品Taq DNA聚合酶、PCR試劑(Buffer、MgCl2、dNTPs 等)、DL2000 DNA Marker為大連寶生物公司產(chǎn)品

1.3 蟲(chóng)體總DNA的提取

每個(gè)成蟲(chóng)取一小段(1～2 cm)，分別放入不同的平皿中，用雙蒸水反復(fù)沖洗后，分別放在已滅菌的1.5 mL離心管中，剪碎并研磨，分別加入30 μL蛋白酶K(50 μg/uL)和270 μL SDS裂解液，置于 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜消化。用Promega公司的DNA抽提試劑盒提取蟲(chóng)體DNA。提取的DNA樣品置于–20 ℃的冰箱保存、備用。

1.4 目的基因片段的擴(kuò)增

根據(jù)GenBank上已發(fā)表的豬蛔蟲(chóng)mtDNA序列[13]設(shè)計(jì)了用于擴(kuò)增人蛔蟲(chóng)和豬蛔蟲(chóng)線粒體 nad5基因部分序列(pnad5)的引物(nad5–FS1:5′–TAGAGGGG CTATGAATACTG–3′; nad5–RA1: 5′– ACGGCCATC TTGTTGACCTA–3′)，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。 擴(kuò)增體系為25 μL：ddH2O 15.75 μL；10× r–Taq PCR Buffer(Mg2+free) 2.5 μL；MgCl2(25 mmol/L 3.0 μL；dNTPs (2.5 mmol/L) 2.0 μL；引物 nad5–FS1 (50 mmol/L) 0.25 μL；引物nad5–RA1(50 mmol/L) 0.25 μL；r–Taq酶(5 U/μL) 0.25 μL；模板DNA 1.0 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。

PCR產(chǎn)物用1%TBE瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)

1.5 序列的分析測(cè)定

將PCR產(chǎn)物送北京華大技術(shù)有限公司測(cè)序；利用DNAStar5.01軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 nad5基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

所有樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到均為516 bp(去掉上下游引物)的pnad5片段，與預(yù)期的目的片段長(zhǎng)度相符，且無(wú)非特異性擴(kuò)增條帶(圖1)。

圖1 人蛔蟲(chóng)和豬蛔蟲(chóng)樣品nad5 序列PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR–amplified results of mtDNA nad5 from representative human and pig Ascaris samples

2.2 序列分析

對(duì) 15個(gè)人蛔蟲(chóng)、豬蛔蟲(chóng)樣品進(jìn)行核苷酸序列分析的結(jié)果顯示，A+T的含量為68.60%～69.38%，這與已報(bào)道的豬蛔蟲(chóng)線粒體基因 AT含量(69.19%)一致。對(duì)同一地區(qū)的豬蛔蟲(chóng)樣品pnad5序列的差異性進(jìn)行比較，廣州的差異性為0.2%～0.8%，深圳的差異性為0.2%～0.6%；湛江樣品的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而對(duì)這4個(gè)地區(qū)樣品之間的序列進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)存在較大的地域差異，差異性在 0%～2.4%。對(duì) 3個(gè)不同地區(qū)的人蛔蟲(chóng)核苷酸序列進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)差異性在 0.2%～0.6%，而把所有的人蛔蟲(chóng)和豬蛔蟲(chóng)樣品序列進(jìn)行比較分析，它們的差異性在0.0%～2.6%。

將所獲得的人蛔蟲(chóng)與豬蛔蟲(chóng)樣品分別與GenBank上發(fā)表的豬蛔蟲(chóng)(NC_001327)pnad5序列進(jìn)行比較，差異性為0.2%～2.6%，人蛔蟲(chóng)和豬蛔蟲(chóng)與 GenBank上發(fā)表的貓弓首蛔蟲(chóng)(AM411622)、犬弓首蛔蟲(chóng)(AM411108)、馬來(lái)西亞弓首蛔蟲(chóng)(AM412316)相比差異性較大，分別為 22.9%～23.4%和22.9%～23.4%；22.9%～23.4%和22.6%～23.4%；22.5%～22.8%和21.2%～22.8%。

3 討 論

分子標(biāo)記作為一種遺傳標(biāo)記，為分類學(xué)提供了很好的保障，用分子標(biāo)記(特別是線粒體)來(lái)研究寄生蟲(chóng)的遺傳進(jìn)化具有其優(yōu)勢(shì)[17–18]。本研究中的線粒體 nad5基因，是研究物種系統(tǒng)進(jìn)化與分類的一種理想的分子標(biāo)記[19]。筆者對(duì)來(lái)自國(guó)內(nèi)的人和豬蛔蟲(chóng)線粒體 nad5基因序列進(jìn)行了遺傳變異分析，結(jié)果表明，人蛔蟲(chóng)和豬蛔蟲(chóng)與犬弓首蛔蟲(chóng)、貓弓首蛔蟲(chóng)、馬來(lái)西亞弓首蛔蟲(chóng)相比差異較大，而人蛔蟲(chóng)和豬蛔蟲(chóng)的nad5序列差異性僅為0.0%～2.6%，支持人蛔蟲(chóng)與豬蛔蟲(chóng)是同一個(gè)種的觀點(diǎn)[20–22]。

本研究中有限的樣品來(lái)源和pnad5所包含的有限的信息量都不利于精確分析人蛔蟲(chóng)與豬蛔蟲(chóng)的關(guān)系，而線粒體DNA受漸滲雜交和基因滲透等現(xiàn)象影響[23]，這種現(xiàn)象也阻礙人蛔蟲(chóng)與豬蛔蟲(chóng)的準(zhǔn)確分類；因此，要想更準(zhǔn)確地推演出人蛔蟲(chóng)與豬蛔蟲(chóng)是同一個(gè)種，還需進(jìn)一步采用突變掃描測(cè)序法詳細(xì)的檢查來(lái)自不同地方和宿主的蛔蟲(chóng)線粒體和核糖體DNA的變異；使用分子檢測(cè)工具，建立有效的方法去確定是否人和豬蛔蟲(chóng)有宿主特異性和交叉感染在流行區(qū)；建立感染試驗(yàn)，使用來(lái)源于人的蛔蟲(chóng)(特異性驗(yàn)證)去感染豬。

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責(zé)任編輯：羅 維

英文編輯：羅 維

Ascaris lumbricoides and Ascaris suum represent the same species based on sequence analysis of mitochondrial nad5 gene

WU Chang-yi1, LIN Rui-qin2, HE Yong3, LIU Guo-hua4*
(1.Animal Husbandry and Veterinary Technical Service Center of Bishan County, Bishan, Chongqing 402760, China; 2.College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 3.Xinxiang University, Xinxiang, Henan 453003, China; 4.College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

Ascaris lumbricoides (A. lumbricoides) and Ascaris suum (A. suum) were collected from different areas in China to examine the sequence variation of mitochondrial NAPH dehydrogenase subuit 5 gene(nad5) by amplifying patial nad5 (pnad5) followed by sequence analysis. The results showed that the length of pnad5 sequences was 556 bp, sequence differences in the pnad5 was 0.0%～2.6% between the A. lumbricoides and A. suum samples. These results support that the A. lumbricoides and A. suum represent the same species.

Ascaris lumbricoides; Ascaris suum; mitochondrial DNA; nad5; sequence analysis

10.13331/j.cnki.jhau.2014.01.013網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2014– – 00:00

Q958.9；Q959.17.2+.6

A

1007?1032(2014)01?0061?04

人蛔蟲(chóng)(Ascaris lumbricoides)與豬蛔蟲(chóng)(Ascaris suum)屬于大型寄生線蟲(chóng)，分別寄生于人和豬的小腸內(nèi)。人感染蛔蟲(chóng)可引起重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題。據(jù)估計(jì)，全球大約有1.2億人感染蛔蟲(chóng)，在熱帶和亞熱帶地區(qū)蛔蟲(chóng)感染十分普遍[1]。豬感染蛔蟲(chóng)，可導(dǎo)致精神沉郁、消瘦、貧血、黃疸、腹瀉、生長(zhǎng)不良等，甚至可引起仔豬死亡，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，同時(shí)也給國(guó)民經(jīng)濟(jì)帶來(lái)巨大損失[1]。許多國(guó)家已將人蛔蟲(chóng)和豬蛔蟲(chóng)納入公共衛(wèi)生學(xué)范疇[2–3]。長(zhǎng)久以來(lái)，關(guān)于人蛔蟲(chóng)與豬蛔蟲(chóng)的分類一直存有爭(zhēng)議。一些學(xué)者認(rèn)為人蛔蟲(chóng)和豬蛔蟲(chóng)是同一個(gè)種，而另外一些學(xué)者則認(rèn)為是2個(gè)不同的種。為此，許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者從形態(tài)學(xué)、生理生化、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等方面對(duì)這2種線蟲(chóng)進(jìn)行了比較研究，但得到的結(jié)果也不盡相同[4–6]。

2013–07–31

教育部“長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”項(xiàng)目(IRT0723)

吳昌義(1984—)，女，重慶榮昌人，碩士，主要從事分子寄生蟲(chóng)研究，wucy198499@126.com；*通信作者，liuguohua5202008 @163.com