姚 霏 張露蓉 江國榮

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院吳門醫(yī)派研究院，江蘇 蘇州 215009)

實(shí)驗(yàn)研究

玉屏風(fēng)散對Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠T淋巴細(xì)胞表型的影響※

姚 霏 張露蓉 江國榮△

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院吳門醫(yī)派研究院，江蘇 蘇州 215009)

目的探討玉屏風(fēng)散對肝癌荷瘤小鼠T淋巴細(xì)胞表型的影響。方法以皮下接種腫瘤細(xì)胞建立荷瘤C57BL/6小鼠模型，隨機(jī)分為模型對照組、玉屏風(fēng)散組(20、25、30 g生藥/kg)，并選取不荷瘤小鼠為正常對照組，每組各5只。玉屏風(fēng)散組按20 mL/kg灌以生藥濃度為1.00、1.25、1.50 g/mL)的玉屏風(fēng)散濃縮液，每日1次，正常對照組與模型對照組灌以等容積0.9%氯化鈉注射液，連續(xù)給藥2周。2周后處死小鼠制備脾細(xì)胞懸液，應(yīng)用免疫熒光標(biāo)記法，采用流式技術(shù)檢測和分析小鼠脾臟中CD4+CD25+、CD4+CD69+、CD8+CD69+、CD8+CD44+、CD8+CD44+CD62L-及CD8+CD44+CD62L+T細(xì)胞比例的變化。結(jié)果與正常對照組比較，玉屏風(fēng)散組脾CD4+CD25+T細(xì)胞比例均下降(P<0.05，P<0.01)；CD4+CD69+、CD8+CD69+、CD8+CD44+、CD8+CD44+CD62L-和CD8+CD44+CD62L+T細(xì)胞比例均增加(P<0.05，P<0.01)。與模型對照組比較，玉屏風(fēng)散組脾CD8+CD44+和CD8+CD44+CD62L-T細(xì)胞比例均無變化(P>0.05)；玉屏風(fēng)散20 g生藥/kg組、25 g生藥/kg組CD8+CD69+T細(xì)胞比例增加(P<0.05)；玉屏風(fēng)散30 g生藥/kg組CD4+CD25+T細(xì)胞比例有降低趨勢，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CD4+CD69+和CD8+CD69+T細(xì)胞比例均下降(P<0.05，P<0.01)；CD8+CD44+CD62L+T細(xì)胞比例增加(P<0.01)。結(jié)論玉屏風(fēng)散通過降低CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞活化，增加記憶型CD8+T細(xì)胞比例，從而改善肝癌小鼠免疫紊亂狀態(tài)，發(fā)揮抗腫瘤作用。

玉屏風(fēng)散；肝腫瘤；疾病模型，動(dòng)物；小鼠；T淋巴細(xì)胞；表型

玉屏風(fēng)散為中醫(yī)扶正固表的經(jīng)典名方，出自元·朱丹溪的《丹溪心法》，由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)3味藥材組方而成。現(xiàn)代藥理研究證明玉屏風(fēng)散具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功能[1-2]，可促進(jìn)荷瘤小鼠T細(xì)胞的增殖[3]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究也表明玉屏風(fēng)散具有微弱的直接抑瘤作用，主要通過對肝癌荷瘤小鼠免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，提高機(jī)體特異性T細(xì)胞的免疫功能尤其明顯[4]。

T細(xì)胞是機(jī)體極為重要的免疫細(xì)胞，其介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。它表面存在諸多表面分化抗原CD，包括CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞2個(gè)亞群，在T細(xì)胞的活化過程中發(fā)揮重要功能，同時(shí)也是鑒定T細(xì)胞亞群的重要表面標(biāo)志[5]。CD4+代表輔助性T細(xì)胞，CD8+代表抑制性和細(xì)胞毒性T細(xì)胞，CD4+、CD8+彼此相互調(diào)節(jié)，表現(xiàn)出輔助和抑制的作用，是免疫系統(tǒng)的核心[6]。當(dāng)二者比例失調(diào)，這種對立統(tǒng)一的關(guān)系被破壞，導(dǎo)致免疫狀態(tài)失衡，產(chǎn)生免疫功能紊亂。CD4+CD25+T細(xì)胞作為一類調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[7]，在腫瘤患者中表現(xiàn)為比例升高，提示該類細(xì)胞在腫瘤免疫中起下調(diào)作用[8]。CD69分子被稱為活化誘導(dǎo)分子(AIM)[9]，靜止的T淋巴細(xì)胞一般不表達(dá)CD69，T細(xì)胞通過T細(xì)胞抗原受體(TCR)接受CD3/TCR復(fù)合物、植物血凝素(PHA)、蛋白激酶C激活物佛波酯(PMA)等刺激信號后，細(xì)胞表面就合成和表達(dá)一些新的糖蛋白，包括CD69、白細(xì)胞介素-2(IL-2)受體CD25、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體CD71，這些分子被稱為活化標(biāo)志，其中最早表達(dá)的是CD69[10-11]，刺激后1～2 h即可在T細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)[12]，可用于評價(jià)T淋巴細(xì)胞的活化狀態(tài)及活化效率。CD44及選擇素-L(Selectin-L，亦稱CD62L)為最主要的淋巴細(xì)胞歸巢受體，介導(dǎo)淋巴細(xì)胞與組織中高內(nèi)皮小靜脈(HEV)的內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，參與淋巴細(xì)胞再循環(huán)。而且，細(xì)胞活化可致其表面的CD62L脫落。因此，通常認(rèn)為CD44+CD62L-為效應(yīng)T細(xì)胞的表達(dá)，而CD44+CD62L+為記憶型T細(xì)胞的表達(dá)。

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步圍繞T細(xì)胞不同功能的亞群，觀察玉屏風(fēng)散對荷瘤肝癌小鼠T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的影響及機(jī)制，為臨床應(yīng)用玉屏風(fēng)散治療肝癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級近交C57BL/6純系雄性小鼠25只，體質(zhì)量(20±2) g，購自蘇州愛爾麥特科技有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號：SCXK(蘇)2009-001。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 黃芪、白術(shù)、防風(fēng)均由蘇州市春暉堂藥業(yè)有限公司提供(批號均為100601)。按黃芪∶白術(shù)∶防風(fēng)為3∶1∶1的比例，加入加3倍量低溫水，浸泡0.5 h，再加入5倍量水，回流提取1.5 h，過濾；取藥渣再加入6倍量水，回流提取1 h，合并2次濾液。濾液濃縮適量，使得到濃度為1.00 g、1.25 g、1.50 g/mL(折合生藥)的濃縮液，-4 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 細(xì)胞株 Hepa1-6小鼠肝癌細(xì)胞，由蘇州大學(xué)生命科學(xué)院惠贈(zèng)。

1.1.4 試劑 DMEM培養(yǎng)液(GIBCO公司，批號1320158)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批號100511)；疊氮鈉(NaN3，上?；瘜W(xué)試劑供應(yīng)站，批號890425)；Anti-Mouse CD4 FITC(eBioscience公司，批號E00078-133)；Anti-Mouse CD8a PerCP-Cy5.5(eBioscience公司，批號E08300-1630)；Rat Anti-Mouse CD44 R-PE(invitrogen公司，批號282899G)；Anti-Mouse CD62L APC(eBioscience公司，批號E07168-1630)；Anti-Mouse CD25 APC(eBioscience公司，批號E07105-1631)；Anti-Mouse CD69 FITC(eBioscience公司，批號E07175-1225)；碳酸氫鉀、氯化銨、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)、磷酸緩沖鹽(PBS)、流式細(xì)胞儀檢測緩沖液(FACS buffer)等試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.5 儀器 微量移液器，美國eppendorf公司；賀利氏二氧化碳培養(yǎng)箱，美國科峻儀器公司；Leica DMIL倒置顯微鏡，德國徠卡儀器有限公司；Z 320K低溫高速離心機(jī)，德國HERMLE公司；流式細(xì)胞儀，美國BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組及給藥 選取20只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后用于種瘤。無菌條件下，取對數(shù)生長期的Hepa1-6細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將Hepa1-6細(xì)胞消化后，用PBS稀釋成1×107/mL的細(xì)胞懸液，接種于小鼠右腋皮下，每只接種0.2 mL以形成實(shí)體瘤，當(dāng)捫及接種小鼠皮下結(jié)節(jié)直徑約達(dá)5 mm時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為4組，每組5只。選取5只不荷瘤小鼠為正常對照組。分組當(dāng)日開始給藥，玉屏風(fēng)散組按20 mL/kg給予生藥濃度為1.00、1.25、1.50 g/mL的玉屏風(fēng)散濃縮液灌胃，正常對照組與模型對照組灌以等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃，每日1次，連續(xù)給藥2周。

1.2.2 脾細(xì)胞懸液的制備 小鼠末次給藥24 h后給予放血斷髓處死，快速剖開腹腔，取脾，去除周圍的結(jié)締組織，稱質(zhì)量記錄，剪碎脾臟，在毛玻片上磨細(xì)，過200目尼龍網(wǎng)，收集濾液，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入10～15 mL紅細(xì)胞裂解液，混懸脾細(xì)胞，靜置10～20 min后1 000 r/min離心5 min，棄上清，再用PBS洗一遍細(xì)胞，最后加1 mL FACS buffer重新懸浮細(xì)胞。以上操作均在冰上進(jìn)行。利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板，鏡下計(jì)數(shù)并記錄。

1.2.3 免疫熒光標(biāo)記法檢測 于96孔板中加入50 μL 用FACS buffer懸浮好的脾細(xì)胞，加入50 μL 已經(jīng)用FACS buffer稀釋好的各抗體(CD4、CD8、CD25、CD69、CD44及CD62L)，與細(xì)胞混勻(每孔約1×105～6個(gè)細(xì)胞)，4 ℃避光孵育30 min。每孔加入150 μL FACS buffer洗滌細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min。棄200 μL上清液，加200 μL FACS buffer洗滌細(xì)胞2遍，1 200 r/min離心5 min。加200 μL FACS buffer，轉(zhuǎn)移到流式管中，上流式細(xì)胞儀檢測。每個(gè)樣本收集10 000個(gè)細(xì)胞用于數(shù)據(jù)分析，采用FLOWJO軟件處理樣品數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 玉屏風(fēng)散對Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠CD4+CD25+T細(xì)胞比例的影響 見表1。

組 別nCD4+CD25+T細(xì)胞正常對照組53．14±0．42模型對照組52．54±0．39?玉屏風(fēng)散20g生藥/kg組53．28±0．96玉屏風(fēng)散25g生藥/kg組53．08±0．86玉屏風(fēng)散30g生藥/kg組52．00±0．56??

與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

由表1可見，與正常對照組比較，模型組和玉屏風(fēng)散30 g生藥/kg組CD4+CD25+T細(xì)胞比例均明顯下降(P<0.05，P<0.01)。與模型對照組相比，玉屏風(fēng)散20、25 g生藥/kg組CD4+CD25+T細(xì)胞比例有上升趨勢，玉屏風(fēng)散30 g生藥/kg組CD4+CD25+T細(xì)胞比例有進(jìn)一步降低趨勢，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。玉屏風(fēng)散各劑量組之間互相比較，隨著劑量增加，CD4+CD25+T細(xì)胞比例呈現(xiàn)逐步降低，但組別之間均無顯著變化(P>0.05)。

2.2 玉屏風(fēng)散對Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠CD4+CD69+、CD8+CD69+T細(xì)胞比例的影響 見表2。

組 別nCD4+CD69+T細(xì)胞CD8+CD69+T細(xì)胞正常對照組50．43±0．110．24±0．03模型對照組50．68±0．06??0．31±0．05?玉屏風(fēng)散20g生藥/kg組50．69±0．12??0．46±0．07??△△玉屏風(fēng)散25g生藥/kg組50．69±0．16?0．47±0．10??△玉屏風(fēng)散30g生藥/kg組50．30±0．10△△0．23±0．02△

與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01

由表2可見，與正常對照組比較，模型對照組和玉屏風(fēng)散20、25 g生藥/kg組CD4+CD69+、CD8+CD69+T細(xì)胞比例明顯增加(P<0.05，P<0.01)；但玉屏風(fēng)散30 g生藥/kg組CD4+CD69+和CD8+CD69+T細(xì)胞比例均略有下降(P>0.05)。與模型對照組相比，玉屏風(fēng)散20、25 g生藥/kg組CD4+CD69+T細(xì)胞比例無變化(P>0.05)，CD8+CD69+T細(xì)胞比例則明顯增加(P<0.05)；但玉屏風(fēng)散30 g生藥/kg組CD4+CD69+和CD8+CD69+T細(xì)胞比例均明顯下降(P<0.05，P<0.01)。

2.3 玉屏風(fēng)散對Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠CD8+CD44+、CD8+CD44+CD62L-及CD8+CD44+CD62L+T細(xì)胞比例的影響 見表3。

組 別nCD8+CD44+T細(xì)胞CD8+CD44+CD62L-T細(xì)胞CD8+CD44+CD62L+T細(xì)胞正常對照組535．87±1．4024．99±1．3310．88±1．84模型對照組545．09±5．45?31．02±5．9114．08±2．77玉屏風(fēng)散20g生藥/kg組550．12±6．52??35．59±7．04?14．54±2．62?玉屏風(fēng)散25g生藥/kg組549．59±6．41??34．62±7．12?14．99±2．84?玉屏風(fēng)散30g生藥/kg組551．09±5．12??31．08±4．57?20．00±1．71??△△

與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型對照組比較，△△P<0.01

由表3可見，與正常對照組比較，模型對照組和玉屏風(fēng)散組的CD8+CD44+T細(xì)胞比例均明顯增高(P<0.05，P<0.01)；玉屏風(fēng)散組的CD8+CD44+CD62L-和CD8+CD44+CD62L+T細(xì)胞比例同樣明顯增加(P<0.05，P<0.01)。與模型對照組相比，玉屏風(fēng)散組CD8+CD44+和CD8+CD44+CD62L-T細(xì)胞比例變化不明顯(P>0.05)；而玉屏風(fēng)散30 g生藥/kg組的CD8+CD44+CD62L+T細(xì)胞比例明顯增加(P<0.01)。

3 討 論

前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在腫瘤狀態(tài)下，玉屏風(fēng)散對CD4+T和CD8+T比例無影響，也無劑量依賴性，反映玉屏風(fēng)散在一定劑量范圍內(nèi)，發(fā)揮對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，以維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定[4]。

CD4+CD25+T細(xì)胞比例下降，表現(xiàn)為T細(xì)胞免疫的增強(qiáng)；高劑量的玉屏風(fēng)散(30 g生藥/kg)可以使其進(jìn)一步下降，提示玉屏風(fēng)散可以通過降低CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T比例，上調(diào)荷瘤小鼠的免疫狀態(tài)，達(dá)到抗腫瘤的效應(yīng)。玉屏風(fēng)散20 g、25 g生藥/kg可以使荷瘤小鼠脾臟中CD8+CD69+T細(xì)胞比例進(jìn)一步明顯增加(P<0.05)，這提示玉屏風(fēng)散有促進(jìn)CD8+T淋巴細(xì)胞活化的作用，發(fā)揮T淋巴細(xì)胞，尤其是細(xì)胞毒性T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。但玉屏風(fēng)散30 g生藥/kg劑量組明顯降低荷瘤小鼠脾臟中CD4+CD69+和CD8+CD69+T細(xì)胞比例(P<0.05，P<0.01)，且降低至正常小鼠的水平，這其中的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。這可能與玉屏風(fēng)散對免疫調(diào)節(jié)作用主要體現(xiàn)維持機(jī)體內(nèi)的免疫平穩(wěn)狀態(tài)有關(guān)。荷瘤小鼠脾臟中CD8+CD44+CD62L-和CD8+CD44+CD62L+T細(xì)胞比例均增高，表明荷瘤小鼠細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性增強(qiáng)；玉屏風(fēng)散可以保持這種增高狀態(tài)，而且高劑量玉屏風(fēng)散(30 g生藥/kg)可進(jìn)一步增加荷瘤小鼠脾臟中CD8+CD44+CD62L+T細(xì)胞的比例(P<0.01)，提示玉屏風(fēng)散可保持荷瘤小鼠細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性的免疫增強(qiáng)狀態(tài)，并增加記憶型CD8+T細(xì)胞比例，增強(qiáng)了荷瘤小鼠對Hepa1-6腫瘤細(xì)胞的特異性T細(xì)胞免疫的激活。

玉屏風(fēng)散對Hepa1-6肝癌小鼠免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制可能是通過降低CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例，促進(jìn)CD8+T淋巴細(xì)胞活化，增加記憶型CD8+T細(xì)胞比例，從而改善荷瘤小鼠免疫紊亂狀態(tài)，達(dá)到抗腫瘤的效應(yīng)。但由于實(shí)驗(yàn)方法的局限性，需要進(jìn)一步采用原位種植荷瘤小鼠模型或基因敲除誘導(dǎo)型腫瘤模型，觀察玉屏風(fēng)散對腫瘤免疫調(diào)節(jié)的特點(diǎn)。

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(本文編輯：李珊珊)

·信息·

2013年度中國藥學(xué)發(fā)展獎(jiǎng)?lì)C獎(jiǎng)

5月7日，2013年度中國藥學(xué)發(fā)展獎(jiǎng)?lì)C獎(jiǎng)大會(huì)在京舉行，中國藥科大學(xué)王廣基院士榮獲特殊貢獻(xiàn)獎(jiǎng)。來自中國科學(xué)院上海藥物研究所、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所等單位的17位專家分別獲得創(chuàng)新藥物獎(jiǎng)、康辰骨質(zhì)疏松醫(yī)藥研究獎(jiǎng)以及食品藥品質(zhì)量檢測技術(shù)獎(jiǎng)。

中國藥學(xué)發(fā)展獎(jiǎng)是經(jīng)科技部首批批準(zhǔn)的26個(gè)全國性獎(jiǎng)項(xiàng)之一，是由社會(huì)力量設(shè)立的全國性醫(yī)藥學(xué)獎(jiǎng)項(xiàng)，每兩年頒獎(jiǎng)一次。該獎(jiǎng)項(xiàng)旨在獎(jiǎng)勵(lì)在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域作出突出貢獻(xiàn)或取得重大科技成果的醫(yī)藥學(xué)科技工作者，促進(jìn)醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展。此次會(huì)議由中國藥學(xué)發(fā)展獎(jiǎng)獎(jiǎng)勵(lì)工作委員會(huì)和中國藥學(xué)會(huì)聯(lián)合主辦。

InfluenceofYupingfengpowderonTlymphocytesphenotypeinHepa1-6HCCtumor-bearingmice

YAOFei，ZHANGLurong，JIANGGuorong.

Wu’sInstituteofMedicalSchool，SuzhouHospitalofTraditionalChineseMedicineAffiliatedtoNanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jiangsu，Suzhou215009

ObjectiveTo research the effect of Yupingfeng powder on T lymphocytes phenotype in Hepa1-6 HCC tumor-bearing mice.MethodsA tumor-burdened C57BL / 6 mice model were established by injecting Hepa1-6 cells into mice intradermally. Model mice were randomly divided into model group，low-，middle-，and high-dose (20，25，30g crude drug/kg) Yupingfeng powder group. Not tumor-burdened mice were chosen in the control group. Yupingfeng powder concentrated solution was given in low-，middle-，and high-dose (20，25，30 g crude drug/kg) Yupingfeng powder group，once a day. Control group and model group was fill in with the same amount of saline solution，for two weeks in a row. After two weeks CD4，CD8，CD25，CD69，CD44 and CD62L were analyzed by immunofluorescence method and flow cytometry.ResultsCompared with control group，the proportion of CD4+CD25+T Cells in Yupingfeng powder group were reduced (P<0.05，P<0.01); the proportion of CD4+CD69+，CD8+CD69+，CD8+CD44+，CD8+CD44+CD62L-and CD8+CD44+CD62L+T Cells were increased (P<0.05，P<0.01). There was no difference between model group and Yupingfeng powder group on the proportion of CD8+CD44+and CD8+CD44+CD62L-T cells (P>0.05). The ratio of CD8+CD69+T Cells in mid and low dose Yupingfeng powder group were increased (P<0.05); the proportion of CD4+CD25+T Cells had reducing trend in high dose group，but did not have any statistical significance; the proportion of CD4+CD69+and CD8+CD69+T Cells both reduced (P<0.05，P<0.01); the proportion of CD8+CD44+CD62L+T Cells increased (P<0.01).ConclusionYupingfeng powder have antineoplastic effects which are embodied in these areas，it can reduce the ratio of CD4+CD25+regulatory T Cell，improve the activation of CD8+T cells，raise the ratio of memory CD8+T cells and then improve the immunologic derangement state of C57 mice.

Yupingfeng powder; Liver cancer; Disease models; Animal; Mouse; T lymphocytes; Phenotype

※ 項(xiàng)目來源：2009—2010年度江蘇省中醫(yī)藥科技項(xiàng)目(編號：LZ09119)；蘇州市2009年度高層次人才資助項(xiàng)目(編號：2009-07)；2009年蘇州市科教興衛(wèi)青年科技項(xiàng)目(編號：SWKQ0928)；蘇州市2010年度第四批科技發(fā)展計(jì)劃(應(yīng)用基礎(chǔ)研究)項(xiàng)目(編號：SYS201053)

△ 通訊作者：江蘇省蘇州市中醫(yī)醫(yī)院吳門醫(yī)派研究院，江蘇 蘇州 215009

姚霏(1985—)，女，中藥師，學(xué)士。研究方向：主要從事中藥與腫瘤免疫工作。

R289.5；R735.7；R331.125

A

1002-2619(2014)05-0742-04

2013-06-21)