申慧芳+申惠敏+賈秀珍等

摘要：用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了高致病性禽流感H5N1 HA蛋白，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)，HA蛋白表達(dá)分子量約為70 ku；將HA蛋白制成油乳液，免疫BALB/c小鼠，免疫3次后，收集血清，以血凝抑制試驗(yàn)（HI）和血清IgG抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）評(píng)估體液免疫，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（ELISPOT）評(píng)估細(xì)胞免疫。試驗(yàn)結(jié)果表明：重組HA蛋白組和全病毒滅活疫苗組免疫小鼠后，血清中和抗體效價(jià)及ELISA IgG效價(jià)均顯著高于PBS 組，重組HA蛋白組和全病毒滅活疫苗組之間差異不顯著。ELISPOT試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，重組HA蛋白組和全病毒滅活疫苗組小鼠脾單個(gè)核細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-4細(xì)胞數(shù)量顯著高于PBS組，而重組HA蛋白組和全病毒滅活疫苗組之間差異不顯著。用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)H5N1 HA蛋白制成油乳液能誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，能為預(yù)防高致病性禽流感H5N1候選疫苗的篩選提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：H5N1高致病性禽流感；Sf9昆蟲細(xì)胞；HA蛋白；免疫反應(yīng)

中圖分類號(hào)： S855.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）07-0024-04

收稿日期：2014-03-14

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31360212）；廣東省深圳市科技研發(fā)資金基礎(chǔ)研究計(jì)劃（編號(hào)：JC201105201028A）。

作者簡(jiǎn)介：申慧芳（1976—），女，山西長(zhǎng)治人，博士，副教授，主要從事食品安全生物學(xué)研究。E-mail：hethershen@gmail.com。禽流感（avian influenza）是由禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的一種禽類傳染病，其中高致病性禽流感（high pathogenic avian influenza，HPAI）H5N1亞型更是養(yǎng)禽業(yè)的一大災(zāi)難性疾病，不僅給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失；同時(shí)，它正在突破種間屏障，引起人類感染，從病禽直接感染人類病死率高達(dá)60%[1]，給公共衛(wèi)生帶來(lái)威脅?？赏ㄟ^(guò)減少禽對(duì)禽的傳播以及禽對(duì)人類的傳播，并進(jìn)行有效的免疫來(lái)保護(hù)養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展[2]。預(yù)防H5N1高致病性禽流感的傳統(tǒng)疫苗是由雞胚生產(chǎn)的。然而這種方法生產(chǎn)疫苗存在很大的風(fēng)險(xiǎn)，如由于病毒致死雞胚而影響疫苗生產(chǎn)[3]。另外，高致病性禽流感的疫苗生產(chǎn)和處理需要生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室[4]。因此，尋找一種可以替代傳統(tǒng)疫苗而又高效安全的疫苗就成了當(dāng)務(wù)之急。

血凝素蛋白（hemagglutinin，HA）是禽流感病毒最重要的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒吸附、穿膜及決定病毒的宿主特異性和致病力方面均起著關(guān)鍵的作用[5]。HA蛋白也是AIV誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的主要抗原，它刺激機(jī)體所產(chǎn)生的抗體可以中和病毒、抵抗感染[6-7]。因此，HA蛋白成為發(fā)展亞單位疫苗的首選[8]。當(dāng)流感疫情發(fā)生時(shí)，只要分離到流行毒株，進(jìn)行HA基因測(cè)序就可以進(jìn)行序列合成并表達(dá)蛋白，這種方式周期短、產(chǎn)量高，將在流感疫情高發(fā)時(shí)代替?zhèn)鹘y(tǒng)疫苗進(jìn)行快速有效地控制病癥的流行。

本試驗(yàn)選用Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組HA蛋白表達(dá)，用表達(dá)的HA蛋白和H5N1禽流感全病毒滅活疫苗進(jìn)行體液免疫和細(xì)胞免疫評(píng)估，為今后研制快速、高效、安全的H5N1禽流感疫苗提供有效的依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒E. coli DH5α菌種（筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存）；E.coli DH10Bac菌種、pFastbacDual質(zhì)粒、Sf9昆蟲細(xì)胞、Cellfectin Ⅱ Reagent購(gòu)自Invitrogen公司；pMD-18 T載體、Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa公司；sf 900 Ⅱ SFM、Graces Insect Cell Culture Medium 購(gòu)自 GIBCO公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生物工程公司；DNA 膠回收試劑盒、預(yù)染蛋白質(zhì) Marker 購(gòu)自Fermentas公司；顯影液定影液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；ECL顯色液、DAB顯色液均購(gòu)自BBI公司；H5N1高致病性禽流感高免血清購(gòu)自廣東溫氏研究院；HRP標(biāo)記的兔抗雞IgG購(gòu)自KPL公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2試驗(yàn)動(dòng)物6周齡BALB/c小鼠（體質(zhì)量16～18 g/只）購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3陽(yáng)性對(duì)照疫苗本研究免疫組用的陽(yáng)性對(duì)照為肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司生產(chǎn)的重組禽流感病毒滅活疫苗 H5N1亞型，Re-5，獸藥生字（2006）190022098；證書編號(hào)：（2007）獸藥GMP 證字178號(hào)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1HA 基因的獲得參照GenBank中注冊(cè)的禽流感病毒A/goose/GD/96（H5N1）毒株（序列號(hào)HA：NC_007362.1），將HA基因送去Invitrogen公司進(jìn)行核苷酸序列合成。根據(jù)合成的序列設(shè)計(jì)用以擴(kuò)增HA基因的特異性引物，其中上游引物H5N1-HA-F：5′-CGCGGATCCGATGGAGAAAATAGTGC-3′（含BamHⅠ酶切位點(diǎn)）；下游引物H5N1-HA-R：5′-CCGGTCGACTTAAATGCAAATTCTG-3′（含SalⅠ酶切位點(diǎn)）。 PCR擴(kuò)增體系為50 μL，其中5×PCR buffer 10 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）4 μL，模板1 μL，引物各1 μL，Taq酶 0.5 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)至50 μL。純化的PCR產(chǎn)物經(jīng) BamHⅠ 和SalⅠ雙酶切，連接至經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶酶切的質(zhì)粒pFastbacDual，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。酶切鑒定后，篩選出重組質(zhì)粒 pFastbacDual-HA。將陽(yáng)性重組質(zhì)粒 pFastbacDual-HA 轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定后，抽提重組桿粒rBacmid-HA，PCR鑒定時(shí)使用的通用序列參照Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)使用手冊(cè)。所有引物均由上海生物工程有限公司合成。

1.2.2重組蛋白HA的表達(dá)重組的rBacmid-HA通過(guò)CellfectinⅡreagent轉(zhuǎn)染進(jìn)昆蟲細(xì)胞Sf9。將Sf9細(xì)胞置于含有10% FBS（胎牛血清）的Grace昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基，28 ℃孵育。當(dāng)6孔板中每孔細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL時(shí)，讓其吸附 1 h。將 1 μg rBacmid-HA（Bacmid空桿粒作為陰性對(duì)照）溶于 100 μL 不完全培養(yǎng)基中（不含血清或雙抗的Grace培養(yǎng)基）；將5 μL Cellfectin溶于100 μL不完全培養(yǎng)基；兩者混合均勻在室溫孵育 15～45 min后加入Sf9細(xì)胞，28 ℃孵育 5 h，棄去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變后（第 1 代約需4 d），收集含病毒的培養(yǎng)上清，即為第一代重組病毒，記為P1。P1代病毒種子液量少、效價(jià)低，用 P1繼續(xù)感染Sf9細(xì)胞產(chǎn)生效價(jià)高的P2種子液。P2代病毒液感染細(xì)胞后，收集感染72 h 后的細(xì)胞培養(yǎng)上清直接用于后續(xù)檢測(cè)。細(xì)胞用PBS（磷酸鹽緩沖液）洗3次，經(jīng)3次反復(fù)凍融后超聲破碎，然后在4 ℃、12 000 g 條件下離心 10 min，取上清，用12% SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺）膠進(jìn)行蛋白電泳檢測(cè)。

1.2.3表達(dá)產(chǎn)物的鑒定將 SDS-PAGE電泳中得到的蛋白用半干法轉(zhuǎn)至PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上，含3%BSA（牛血清白蛋白）封閉；1 ∶1 000的H5N1禽流感高免血清作為一抗，1 ∶5 000的HRP標(biāo)記的兔抗雞IgG作為二抗，用ECL進(jìn)行顯色。

1.2.4間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)觀察重組蛋白在Sf9細(xì)胞的表達(dá)及定位。在6孔板中以 1×106個(gè)/mL 的濃度接種Sf9細(xì)胞，貼壁2 h后，接種約0.5個(gè)MOI（病毒感染復(fù)數(shù)）的重組桿狀病毒上清。感染48 h后，用PBS 清洗細(xì)胞3 次；用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，PBS 洗細(xì)胞3 次；用預(yù)冷的100%甲醇（4 ℃）處理10 min，PBS清洗3次；3% BSA室溫封閉1 h，PBS 清洗3 次；以H5亞型免疫陽(yáng)性血清為一抗（1 ∶200），37 ℃ 孵育1 h，PBS清洗細(xì)胞3 次；用1 ∶1 000倍稀釋的FITC（異硫氰酸熒光素）標(biāo)記的熒光二抗，37 ℃避光孵育1 h，PBS 清洗細(xì)胞3 次；置于熒光顯微鏡下拍照。

1.2.5油乳液疫苗的制備將定量后的細(xì)胞破碎液與油乳劑按2 ∶1體積混合，高速勻漿，獲得的油乳劑疫苗4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6動(dòng)物分組與免疫試驗(yàn)選取體質(zhì)量16～18 g的6周齡BALB/c 雌性小鼠隨機(jī)分成3組，分別為重組HA蛋白組、H5N1禽流感滅活疫苗組和PBS組（陰性對(duì)照），每組10只。采用頸部皮下多點(diǎn)注射，從6周齡開(kāi)始進(jìn)行免疫，此后每間隔14 d加強(qiáng)免疫1次，共免疫3次，每次免疫劑量為10 μg/只，以HA蛋白含量為標(biāo)準(zhǔn)。3次免疫后，每組隨機(jī)取5只試驗(yàn)小鼠，眼球取血，室溫下分離血清，用HI和ELISA方法檢測(cè)H5N1抗體水平。每個(gè)試驗(yàn)組隨機(jī)取3只小鼠，取脾臟，用淋巴細(xì)胞分離液分離脾淋巴細(xì)胞，進(jìn)行酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（ELISPOT），檢測(cè)分泌IFN-γ與IL-4細(xì)胞因子的細(xì)胞數(shù)量。

1.2.7血凝抑制試驗(yàn)（HI試驗(yàn)）參照《國(guó)家流感中心標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》中的“流感/禽流感病毒血凝抑制試驗(yàn)（HI）操作細(xì)則”進(jìn)行操作。

1.2.8間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)IgG抗體采用棋盤法確定最佳的抗原包被濃度、血清稀釋度。用 100 μL/孔包被96孔板，用1%BSA封閉，加入用0.1% BSA稀釋的待檢血清于上述已包被的反應(yīng)孔中，充分洗滌后，加入 1 ∶10 000 的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，在酶標(biāo)儀上讀取450 nm下的吸光度（D450 nm）。

1.2.9酶聯(lián)免疫吸附斑點(diǎn)試驗(yàn)按達(dá)科為生物公司“酶聯(lián)免疫吸附斑點(diǎn)試驗(yàn)操作細(xì)則”進(jìn)行操作，將ELISPOT板斑點(diǎn)計(jì)數(shù)，并將重組HA蛋白組、全病毒滅活疫苗組及PBS組分別作數(shù)據(jù)間的t檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2結(jié)果與分析

2.1HA基因的克隆

以合成的A/duck/Guangdong/22/2002（H5N1）禽流感HA基因?yàn)槟０澹M(jìn)行PCR擴(kuò)增，將HA的PCR產(chǎn)物和 pFastBacDual 經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后，回收并連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及測(cè)序，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 707 bp，與預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度相符合（圖1），表明已篩選出重組質(zhì)粒pFastBacDual-HA。

2.2重組桿粒構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pFastBacDual-HA轉(zhuǎn)化到DH10Bac中，通過(guò)慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素3種抗性和Blue-Gal藍(lán)白斑篩選得到陽(yáng)性單菌落克隆，提取桿粒rBacmid-HA，用特異性引物M13通過(guò)PCR鑒定重組桿狀病毒，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2）。

2.3Western blot鑒定重組HA蛋白的表達(dá)

將rBacmid-HA病毒種子液以1倍感染復(fù)數(shù)（MOI=1）接種Sf9昆蟲細(xì)胞，收集72 h后的細(xì)胞培養(yǎng)上清，超聲破碎，進(jìn)行Western blot分析，一抗為H5N1亞型禽流感高免血清，二抗為HRP標(biāo)記的兔抗雞IgG，以野生桿狀病毒表達(dá)蛋白作為對(duì)照。如圖3所示，出現(xiàn)分子量約70 ku的單一多肽，證明重組桿狀病毒表達(dá)了HA蛋白。在昆蟲細(xì)胞中，重組HA蛋白沒(méi)有裂解為HA1和HA2亞基。

2.4間接免疫熒光結(jié)果

重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞48 h后進(jìn)行IFA，從而鑒定及定位重組HA蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，重組蛋白高效表達(dá)于細(xì)胞表面（圖4）。

2.5體液免疫

2.5.1免疫BALB/c小鼠血清中HI效價(jià)用重組的HA蛋白油乳液、全病毒滅活疫苗和PBS免疫BALB/c小鼠，檢測(cè)3免后小鼠血清中HI效價(jià)。結(jié)果顯示，免疫重組HA蛋白組和全病毒滅活疫苗組顯著高于PBS對(duì)照組，而重組HA蛋白組和全病毒滅活疫苗組差異不顯著（圖5-A）。

2.5.2免疫BALB/c小鼠血清中IgG抗體水平檢測(cè)用間接ELISA檢測(cè)BALB/c小鼠血清中IgG抗體，結(jié)果顯示，重組HA蛋白組與全病毒滅活疫苗組IgG抗體均有升高，兩者顯著高于PBS組（P<0.05），重組HA蛋白組與全病毒滅活疫苗組差異不顯著（圖5-B）。

2.6免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞中分泌細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4檢測(cè)

用大腸桿菌BL21表達(dá)的HA蛋白作抗原，刺激3次免疫后小鼠脾淋巴細(xì)胞，通過(guò)ELISPOT技術(shù)對(duì)產(chǎn)生的細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，重組HA蛋白組和全病毒滅活疫苗組脾淋巴細(xì)胞經(jīng)刺激后分泌細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4的細(xì)胞數(shù)量均顯著高于PBS組（P<0.05），但重組HA蛋白組和全病毒滅活疫苗組之間差異不顯著（圖6）。

3結(jié)論與討論

H5N1型高致病性禽流感病毒在世界范圍內(nèi)分布廣、危害性大，不僅造成了養(yǎng)禽業(yè)的巨大損失，也影響到人類健康和安全。目前，尚無(wú)特效藥物用于臨床治療，接種疫苗是預(yù)防和控制該病發(fā)生的主要手段和途徑。傳統(tǒng)疫苗用雞胚生產(chǎn)，生產(chǎn)周期長(zhǎng)、生物安全性要求高，無(wú)法應(yīng)對(duì)流感病毒的大范圍流行。本研究用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的重組HA蛋白，表達(dá)效率高、周期短、生物安全性好。 HI試驗(yàn)結(jié)果顯示：重組HA蛋白與全病毒滅活苗免疫產(chǎn)生的效價(jià)相一致，HI效價(jià)的高低與攻毒免疫保護(hù)有直接的相關(guān)[9-15]，HI效價(jià)越高對(duì)禽流感病毒感染的保護(hù)效果越好，保護(hù)的時(shí)間越長(zhǎng)；ELISA結(jié)果表明：重組HA蛋白的IgG抗體與全病毒滅活疫苗之間無(wú)顯著差別；ELISPOT試驗(yàn)結(jié)果表明：重組HA蛋白組可誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答，有利于機(jī)體對(duì)感染病毒和細(xì)胞的直接殺傷，從而快速清除機(jī)體內(nèi)的病毒。

本試驗(yàn)從通過(guò)獲得H5N1 HA基因序列到轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，進(jìn)行HA蛋白高效表達(dá)（分子量約70 ku），以及感染細(xì)胞裂解，制備油乳液，全部過(guò)程只用了約30 d；通過(guò)BALB/c小鼠免疫，刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，為禽流感基因工程亞單位疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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