冰核微生物的研究動(dòng)態(tài)及開發(fā)應(yīng)用前景

王恒生　刁治民　陳克龍等

摘要：冰核微生物是近年來的研究熱點(diǎn)，本文綜述了冰核微生物的研究動(dòng)態(tài)、應(yīng)用現(xiàn)狀，指出了其研究中存在的不足，提出霧霾的形成與冰核微生物相聯(lián)系的觀點(diǎn)，并對冰核微生物開發(fā)前景進(jìn)行了展望，以期為冰核微生物的進(jìn)一步研究開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：冰核微生物；研究動(dòng)態(tài)；應(yīng)用；霧霾；開發(fā)前景

中圖分類號(hào)： Q939.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）07-0017-05

收稿日期：2014-04-08

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31260130、41261020）；國家社會(huì)科學(xué)基金（編號(hào)：10CJY015）；青海省自然科學(xué)基金（編號(hào)：2013-z-902）。

作者簡介：王恒生（1988—），男，安徽合肥人，碩士研究生，研究方向?yàn)橘Y源微生物學(xué)。E-mail：365553207@qq.com。

通信作者：刁治民，教授，主要從事資源微生物學(xué)研究。E-mail：diao_zhimin@126.com。 冰核是引起水由液態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)的物質(zhì)，它可以是無機(jī)物、有機(jī)物等非生物，也可以是生物[1]。冰核存在是結(jié)冰發(fā)生的初始條件，因?yàn)楸丝勺鳛榫Ш硕Y(jié)水分子，使其整齊排列，進(jìn)而誘發(fā)結(jié)冰過程的形成。自然狀態(tài)下，當(dāng)水的溫度高于一定值時(shí)，少量水分子開始有序排列成晶格狀，形成同源冰核，并逐漸形成冰晶。理想狀態(tài)下的小體積純水在將近 -40 ℃ 才會(huì)結(jié)冰[2]。冰核微生物作為一種生物冰核可以誘導(dǎo)水的冰點(diǎn)升高，其分布廣泛，可在-5～-2 ℃下形成規(guī)則、細(xì)膩、微小異質(zhì)冰晶。目前各國研究者對冰核微生物深入開展了基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究，在冰核微生物的分布、種類、影響成冰活性的因素、冰核細(xì)菌分子生物學(xué)及其應(yīng)用等方面取得了較大的進(jìn)展。

1冰核微生物的種類及分布

1.1冰核細(xì)菌

1972年Schnell等首次在即將腐爛的植物葉內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種很重要的成冰核生物源物質(zhì)[3]。同年，F(xiàn)resh從即將腐爛的赤楊（Alnus tenuifolia）樹葉中分離出1株在 -5.0～-2.5 ℃ 下具有冰核活性的細(xì)菌（ice nucleation-active bacteria，簡稱INA）[4]。1974年，Maki等將這一具有冰核活性的細(xì)菌菌株鑒定為丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae），并進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究[5]。目前為止，已發(fā)現(xiàn)4個(gè)屬23個(gè)種或變種的細(xì)菌具有冰核活性。我國發(fā)現(xiàn)的冰核活性細(xì)菌分布在3個(gè)屬17種或變種中，優(yōu)勢種類為丁香假單胞菌和草生歐文氏菌（Erwinia herbicola）。

1.2冰核真菌種類及分布

Kieft于1988年首次報(bào)道紅臍鱗菌（Rhizoplacachrys oleuca）在-1.9 ℃具有冰核活性[6]。目前已報(bào)道了4屬11個(gè)種或變種的冰核真菌，除3種為地衣真菌外，其余8種均為鐮刀菌屬（Fusarium）。冰核真菌分布在地衣、巖石表面、昆蟲體內(nèi)、土壤等，研究證明真菌比細(xì)菌冰核抗熱且耐酸堿、抗紫外線能力強(qiáng)，這些重要的生理生化特性已引起科學(xué)家的關(guān)注，認(rèn)為冰核真菌比冰核細(xì)菌冰核活性穩(wěn)定，更具開發(fā)應(yīng)用前景[7]。

1.3冰核病毒

研究發(fā)現(xiàn)接種黃矮病毒（barley yellow dwarf virus，BYDV）的小麥農(nóng)作物比對照提高霜凍溫度1～2 ℃，且霜凍溫度與病毒含量成正相關(guān)[8]。

其他微生物如硅藻也發(fā)現(xiàn)具有冰核活性。

2冰核微生物的研究現(xiàn)狀

2.1冰核細(xì)菌的分子生物學(xué)研究

目前，關(guān)于冰核的分子生物學(xué)研究主要是以冰核細(xì)菌為研究對象。

2.1.1細(xì)菌的冰核基因研究發(fā)現(xiàn)冰核的成冰活性是由單個(gè)結(jié)構(gòu)基因決定的，每個(gè)冰核基因僅含1個(gè)開放閱讀框架（ORF），長度4.0～7.5 kb，由一系列的24、48、144個(gè)核苷酸重復(fù)單位組成，冰核基因中間部分堿基具有周期性重復(fù)的特點(diǎn)，每個(gè)重復(fù)區(qū)含24個(gè)保守的堿基對，即重復(fù)的八肽 AGTGSTLT 相對應(yīng)的不完整的重復(fù)DNA序列[7]，但不是完全保守。目前已對丁香假單胞菌的冰核基因IceC、InaZ，草生歐文氏菌的冰核基因IceE，熒光假單胞菌的冰核基因InaW、InaA，油菜黃單胞菌的冰核基因InaX和菠蘿歐文氏菌的冰核基因等6個(gè)編碼冰蛋白的基因作了序列測定分析，發(fā)現(xiàn)InaW基因基本上與InaZ相似，InaX的分子序列與InaZ、InaW、InaE基因也具有高度同源性[9]。

2.1.2冰核蛋白冰核形成是由冰核蛋白（ice nucleation protein，INP）誘導(dǎo)的，研究表明冰核活性細(xì)菌分泌的冰核蛋白附著于細(xì)菌細(xì)胞膜上，是一種糖脂蛋白復(fù)合物（lipogly coprotein compound），冰核蛋白在細(xì)胞中聚合，形成一種成冰核活性很強(qiáng)的蛋白復(fù)合物。不同細(xì)菌冰核蛋白有相似的一級(jí)結(jié)構(gòu)，其一級(jí)結(jié)構(gòu)由1個(gè)相對疏水的N-末端結(jié)構(gòu)域、1個(gè)高度親水的C-末端結(jié)構(gòu)域和中心高度重復(fù)的48肽構(gòu)成，各占序列的15%、4%、81%，其中48肽中含Gly、Ala、Sec、Thr，具有親水性，結(jié)構(gòu)上高度保真，是表現(xiàn)冰核活性的重要模板[7]。不同冰核蛋白都含有1個(gè)長度為41～ 68氨基酸殘基的不重復(fù)C端和161～203個(gè)氨基酸殘基的不重復(fù)N端，以及中部960 ～1 296個(gè)氨基酸殘基的核心重復(fù)區(qū)域，該區(qū)域分3個(gè)不同層次的重復(fù)（分別為48、16和8氨基酸重復(fù)單元），其中48氨基酸重復(fù)單元間具高度相似性，每個(gè)48氨基酸重復(fù)單元又可進(jìn)一步分為3個(gè)16氨基酸殘基的中度相似性重復(fù)單元，16氨基酸重復(fù)單元又可進(jìn)一步分為2個(gè)只有8個(gè)氨基酸即 Ala-Gly-Tyr-Gly-Ser-Thr-Leu-Thr 的低度重復(fù)單元，八肽中特異地富含Ala、Gly、Thr和Ser，因此具有親水性特性，在結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出高度保真性，是表現(xiàn)冰核活性最重要的模板。對冰核基因進(jìn)行缺失分析發(fā)現(xiàn)，N-末端的缺失可引起丁香假單胞菌成冰核活性降低，使其臨界溫度降至-5 ℃以下；C-末端的缺失能使成冰核能力完全喪失；中間重復(fù)結(jié)構(gòu)域的連續(xù)缺失也能使成冰核能力相應(yīng)下降[10]。

2.2影響冰核微生物成冰活性的因素

冰核活性細(xì)菌基因必須在其外膜表面表達(dá)組裝成完整的冰核活性蛋白結(jié)酶，且分布達(dá)到一定密度后，才在一定溫度下顯示一定的冰核活性。在不同環(huán)境中，冰核活性蛋白表達(dá)的時(shí)間、數(shù)量以及活性是不同的。影響成冰活性的因素很多，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：

2.2.1溫度冰核活性與溫度呈負(fù)相關(guān)，超過25 ℃時(shí)則成冰活性顯著下降。

2.2.2菌液濃度孫福在等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度在-7～-2 ℃ 時(shí)，冰核活性與菌液濃度呈正相關(guān)，當(dāng)濃度大于108個(gè)/mL時(shí)冰核活性達(dá)到飽和[11]。

2.2.3pH值冰核細(xì)菌生長的pH值在5.0～9.0范圍內(nèi)，最適pH值為7.0。過酸、過堿環(huán)境都會(huì)破壞其冰核活性。

2.2.4生長階段陳慶森等研究發(fā)現(xiàn)分離自楊樹的2株冰核細(xì)菌的冰核活性在MPDA培養(yǎng)基的營養(yǎng)組分沒有表現(xiàn)出特殊的要求，都在生長到對數(shù)期后期為冰核蛋白的高表達(dá)時(shí)期，并于穩(wěn)定期后期活性最高[12]。

2.2.5其他因素冰核細(xì)菌和冰核蛋白對重金屬離子、化學(xué)試劑、蛋白酶、植物外源凝集素等試劑敏感，對紫外線、放射性元素的照射、抗菌素以及高溫脅迫、臭氧[13]也敏感。

2.3冰核微生物與農(nóng)作物霜凍關(guān)系的研究

2.3.1冰核微生物對農(nóng)作物霜凍的加劇霜凍是造成農(nóng)作物減產(chǎn)減收的嚴(yán)重災(zāi)害。長期以來，人們一直認(rèn)為是低溫導(dǎo)致植物霜凍，但自1972年Schnell等發(fā)現(xiàn)在腐爛的植物葉子內(nèi)有細(xì)菌參與冰核的形成后，人們才逐漸認(rèn)識(shí)到霜凍的形成不完全是由低溫引起的，冰核細(xì)菌也參與了冰核的形成，二者相互作用[14]。冰核微生物廣泛存在于腐生植物表面，在 -5～-2 ℃ 的條件下誘發(fā)植物體內(nèi)形成冰晶，造成植物霜凍，破壞植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，致使植物死亡。通常，無冰核細(xì)菌附生的植物可在-8～-7 ℃的低溫下正常生長，因此冰核微生物可誘發(fā)和加重植物的凍害。

劉建華等利用霜凍模擬試驗(yàn)與田間試驗(yàn)研究了玉米、大豆的霜凍機(jī)制與從作物上分離得到的2種冰核細(xì)菌間的數(shù)量關(guān)系。當(dāng)玉米和大豆葉片噴灑有5×108個(gè)/mL濃度的冰核細(xì)菌時(shí)，葉溫-3～-2.5 ℃時(shí)就嚴(yán)重受害，而對照組則在 -7～-6 ℃ 時(shí)才嚴(yán)重受害，且霜凍程度與冰核細(xì)菌濃度呈正相關(guān)[15]。韋建福等從蠶豆、玉米等植物中分離得到12株具有冰核活性的真菌，經(jīng)鑒定均為燕麥鐮刀菌（Fusarium avenaceum）[16]。鄭國華等以枇杷（Eriobotrya japonica）為試驗(yàn)材料，在接種冰核細(xì)菌后人工降溫，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長，葉片褐變率不斷上升，相同時(shí)間內(nèi)，冰核細(xì)菌處理的枇杷葉片褐變率為無菌組的2～3倍，且溫度愈低，冰核細(xì)菌處理的枇杷褐變率愈高[17]。牛先前等研究發(fā)現(xiàn)冰核細(xì)菌不同程度地加重了凍害脅迫對枇杷果肉細(xì)胞壁、線粒體和葉綠體的破壞程度，其中對葉綠體的破壞最為顯著，其次是細(xì)胞壁、線粒體[18]。在-3～-2 ℃下，相比于對照組，接種冰核細(xì)菌的杏花器官的褐變率隨溫度的降低而加重，花器官細(xì)胞膜透性遭受嚴(yán)重破壞，細(xì)胞中丙二醛（MDA）顯著上升，而MDA是膜脂過氧化作用最終產(chǎn)物，是膜系統(tǒng)受害的重要標(biāo)志之一。說明冰核細(xì)菌是誘發(fā)和加重仁用杏霜凍危害的重要因素[19-20]。

2.3.2冰核微生物在農(nóng)作物上的分布、消長動(dòng)態(tài)研究冰核細(xì)菌在植物體上的數(shù)量消長變化受降雨量多少、溫度高低、濕度大小影響[21]。當(dāng)氣溫平均在10～25 ℃，雨量多、濕度大，又逢春末秋初霜凍易發(fā)季節(jié)時(shí)，冰核細(xì)菌出現(xiàn)頻率高、數(shù)量較多，容易分離到；當(dāng)平均氣溫高于30 ℃，處于盛夏季節(jié)時(shí)，冰核細(xì)菌分布數(shù)量就很少，難以分離到甚至分離不到。此外，人類活動(dòng)對冰核細(xì)菌濃度的變化也可能有重要影響[22]。

目前對冰核微生物分布、消長動(dòng)態(tài)的研究主要集中在細(xì)菌方面，研究表明：冰核細(xì)菌種類分布受植物種類、地域范圍、氣象因素和不同的制約而有差異。如在黃瓜、番茄和十字花科植物上主要分布P. syringae菌群，而在香蕉和禾本科植物上主要分布著E. herbicola菌群；在云南、廣西亞熱帶地區(qū)，冬季發(fā)生霜凍季節(jié)，主要分布著E. herbicola菌群，其次是P. syringae菌群，而在北方溫帶的春、秋霜凍季節(jié)，以熒光假單胞菌類為多，其次是E. herbicola菌群[7]。孫福等在研究了玉米上冰核細(xì)菌的消長動(dòng)態(tài)規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)冰核細(xì)菌消長動(dòng)態(tài)變化和數(shù)量分布受玉米不同生長發(fā)育階段影響，冰核細(xì)菌數(shù)量在抽雄到成熟期間最多，達(dá)到107～108 CFU/g，是拔節(jié)至抽雄期數(shù)量的100～1 000倍、苗期至拔節(jié)期數(shù)量的10 000～100 000倍，且冰核細(xì)菌數(shù)量受玉米不同播期影響顯著，晚期播種（5.0×104 CFU/g）<中期播種（7.9×105 CFU/g）<正常播種（1.9×107 CFU/g）[21]。劉新文等研究發(fā)現(xiàn)茶樹上冰核細(xì)菌以假單胞菌屬、黃單胞菌屬、歐文氏菌屬為主，且分離自芽葉的冰核細(xì)菌數(shù)量最多，嫩葉、老葉其次，茶樹品種及不同區(qū)域?qū)Ρ思?xì)菌的分布也是有影響的[23]。

2.4冰核微生物對大氣氣溶膠的冰相核化能力的影響

研究人員已在高海拔地區(qū)甚至在平流層和間層檢測到了微生物及其有機(jī)體，細(xì)菌以氣溶膠的形式在空氣中廣泛存在，是大氣生物氣溶膠的重要組成部分，是一類具活性并可利用營養(yǎng)物質(zhì)而生長繁殖或能夠在養(yǎng)分匱乏的空氣中存留的氣溶膠粒子。單個(gè)細(xì)菌的直徑一般在0.3～10 μm之間，與其他氣溶膠成分結(jié)合組成細(xì)菌氣溶膠，粒徑范圍0.3～100 μm，比大氣細(xì)菌的典型尺寸大得多，這可能是因?yàn)榧?xì)菌與更大顆粒例如土壤顆粒、碎片和塵埃結(jié)合成細(xì)胞叢聚的原因[24-25]，生物氣溶膠是氣溶膠的重要組成成分，能對氣候產(chǎn)生輻射強(qiáng)迫效應(yīng)，其成核效應(yīng)對氣候變化的影響也越來越受關(guān)注。生物氣溶膠包括細(xì)菌、真菌、病毒等微生物粒子、活性粒子如花粉、孢子等，以及由有生命活性的機(jī)體所釋放到空氣中的各種質(zhì)粒（皮毛纖維、皮屑、表皮碎片、植物碎片、蛋白質(zhì)晶體等）的統(tǒng)稱[26-27]。研究發(fā)現(xiàn)生物氣溶膠可作為云凝結(jié)核（CCN）或冰核（IN）[28]誘導(dǎo)過飽和水汽凝結(jié)成液滴、促使過冷卻水滴發(fā)生凍結(jié)形成冰晶，改變大氣云的物理和化學(xué)過程，對大氣化、大氣降水和微生物地球化學(xué)循環(huán)產(chǎn)生影響，其中細(xì)菌氣溶膠是自然界冰核活性最強(qiáng)的異質(zhì)冰核[29-30]。Pratt等研究發(fā)現(xiàn)云中冰相顆粒1/3的冰晶中含有生物氣溶膠[31]。Levin等利用垂直風(fēng)洞測試研究了冰核細(xì)菌液滴的核化活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)冰核細(xì)菌以接觸核的活性最高，凍結(jié)溫度-9～-3 ℃之間[32]。

2.5冰核細(xì)菌對水循環(huán)的潛在影響

冰核細(xì)菌具有高效冰核活性，科學(xué)家推測其在大氣云中的異質(zhì)核化作用可能對大氣降水過程產(chǎn)生顯著影響。Morris等通過不同地點(diǎn)的水樣品中細(xì)菌種群組成分析了P. syringae與水循環(huán)的相互關(guān)系，他們認(rèn)為水的循環(huán)推動(dòng)了細(xì)菌生活史的循環(huán)，植物表面或農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)土壤的冰核細(xì)菌以氣溶膠形式進(jìn)入大氣散布云中并輸送到遠(yuǎn)距離，作為凝結(jié)核核化催化降水事件，然后隨降水在下墊面重新分布，隨后回歸農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)；下墊面系統(tǒng)的選擇性壓力使得各系統(tǒng)中的細(xì)菌種類及其物化和生化特性改變，從而形成了冰核細(xì)菌在水循環(huán)路徑中種群規(guī)模不同、空間分布新格局和新特性的菌種[33]。目前生物冰核在水循環(huán)過程中作用研究尚存在許多不確定性和未知性，需要更深入和廣泛的探索與研究。

3冰核微生物的應(yīng)用現(xiàn)狀

3.1食品工業(yè)中的應(yīng)用

冰核細(xì)菌用于食品冷凍中，可提高食品的過冷點(diǎn)，從而使食品在較高的溫度下發(fā)生凍結(jié)，縮短了凍結(jié)時(shí)間而節(jié)省了大量能源。Jingkun等將草生歐文氏菌（Erwinia herbicola）懸浮液加入無菌水中并在-6 ℃進(jìn)行冷凍試驗(yàn)，使其過冷點(diǎn)提高到-0.82 ℃，而對照組無菌水則一直保持液態(tài)[34]。陳慶森等把冰核活性菌體蛋白碎片應(yīng)用在基圍蝦（Metapenaeus ensis）的低溫微凍保藏技術(shù)中，分別將蝦倒入冰核細(xì)菌液 10 mL，置于-3～-2 ℃的冰箱中，20 d后經(jīng)感官、品質(zhì)和風(fēng)味檢測，發(fā)現(xiàn)蝦體保存良好，此項(xiàng)技術(shù)延長了基圍蝦的保存期，且耗能低[35]。

3.2促凍殺蟲

倉儲(chǔ)害蟲的傳統(tǒng)防治常用熏蒸法或極端溫度處理，前者易殘留在倉儲(chǔ)物上，對人畜造成毒害，后者費(fèi)用昂貴。而利用冰核細(xì)菌防治倉儲(chǔ)害蟲有很大的優(yōu)點(diǎn)。首先不污染環(huán)境，不存在殘留問題，也不會(huì)影響儲(chǔ)糧的品質(zhì)等。其次，在這種小的環(huán)境中便于進(jìn)行人工低溫的控制，防治成本低，易于操作[36]。赤擬谷盜（Tribolium ferrugineum Fadr.）是一種嚴(yán)重的倉儲(chǔ)害蟲，自然狀態(tài)下不容易結(jié)冰，不容易將其消滅。馮玉香等用冰核真菌制劑噴灑蟲體，風(fēng)干后人工降溫至-4.8 ℃即可使赤擬谷盜體內(nèi)結(jié)冰，而未噴灑冰核真菌的蟲體在 -14.9 ℃ 才結(jié)冰，且赤擬谷盜的結(jié)冰溫度與冰核真菌濃度呈正相關(guān)[37]。楊鳳連等研究了冰核活性細(xì)菌對青菜蟲血淋巴系統(tǒng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在相對較高溫度下菜青蟲血淋巴免疫力受到破壞[38]。朱紅等分別以噴霧和喂食法在棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）上接種冰核細(xì)菌，試驗(yàn)表明噴霧法接種可在接種 1 d 后使結(jié)冰溫度提高5.9 ℃，并在棉鈴蟲化蛹后還能將其結(jié)冰溫度提高7.71 ℃，喂食法接種后2 d才出現(xiàn)棉鈴蟲結(jié)冰現(xiàn)象，在蛹上僅能使結(jié)冰溫度提高0.93 ℃[39]。Mignon等以不同濃度的丁香假單胞菌菌懸液接種2種谷物害蟲（Sitophilus granarius和Oryzaephilus surinamensis），研究發(fā)現(xiàn)，2種蟲的死亡率與菌液濃度呈正相關(guān)[40]。

3.3人工降雪、滑雪場的應(yīng)用

1980年，Woerpel以冰核細(xì)菌研制成人工降雪催化劑并申請專利。1985年由美國生產(chǎn)的商品名為Snomax的冰蛋白人工降雪催化劑在滑雪場中使用，使雪的維持時(shí)間延長、雪質(zhì)提高，與其他非生物冰核相比，既節(jié)省了能源又不污染環(huán)境[41]。Snowmax于1994年被首次應(yīng)用于人工降雪，市場前景十分廣闊。我國也掌握了利用冰核細(xì)菌進(jìn)行人工降雪并進(jìn)入應(yīng)用階段。

3.4冰核基因用作報(bào)告基因

冰核細(xì)菌基因的研究應(yīng)用是生物冰核領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，已有研究人員將該基因?qū)氪竽c桿菌中，并成功表達(dá)，使大腸桿菌具有了成冰核活性[10，42]。冰核基因也可以在酵母、細(xì)菌和植物中表達(dá)，產(chǎn)生蛋白具有冰核活性[43]。因此可使冰核基因作為報(bào)告基因，用于細(xì)菌、酵母和植物基因的表達(dá)調(diào)控研究。冰核基因作為一種新型的報(bào)告基因，與通常的報(bào)告基因相比具有快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。

3.5高敏檢測

冰核活性檢測具有靈敏、方便的特點(diǎn)，應(yīng)用于高敏檢測前景廣闊。將冰核基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到沙門氏菌特異性噬菌體加到待測的食品和水中，可檢測其冰核活性，這種檢測方法快速、靈敏、成功率高[44]，可用于檢測食品和水中的致病性沙門氏菌。梁波等采用冰核蛋白展示系統(tǒng)，將木糖脫氫酶（XDH）高效地表達(dá)在菌體表面，結(jié)合紫外可見吸收光譜方法，實(shí)現(xiàn)了D-木糖的檢測[45]。

3.6冰核蛋白表面展示系統(tǒng)的研究

冰核蛋白最廣泛和最成功的應(yīng)用是被用作細(xì)胞表面展示系統(tǒng)的運(yùn)載蛋白，由此構(gòu)建了大量的表達(dá)系統(tǒng)并分別應(yīng)用于蛋白質(zhì)文庫篩選、環(huán)境有毒物質(zhì)的降解、重金屬吸附、生物傳感器等方面。例如郭恒等將編碼狂犬病毒主要免疫保護(hù)性抗原糖蛋白G基因片段融合到丁香假單胞菌冰核蛋白中，構(gòu)建表面展示載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21 （DE3）后16 ℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)，細(xì)胞ELISA試驗(yàn)結(jié)果表明，重組蛋白在大腸埃希菌表面成功展示[46]。研究發(fā)現(xiàn)丁香假單胞菌的冰核蛋白能引導(dǎo)外源蛋白定位于乳酸乳球菌的細(xì)胞膜上，為乳酸菌表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建提供了新的方向[47]。

3.6其他應(yīng)用

明亮認(rèn)為，霜凍和大震間有很好的對應(yīng)關(guān)系與機(jī)制對應(yīng)，通過收集我國歷史上大震前的霜凍數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在每次大地震前，我國都會(huì)出現(xiàn)大范圍的霜凍雨雪天氣，經(jīng)深入分析得出的結(jié)論是：震前地殼內(nèi)應(yīng)力增加裂縫增多，使大量土壤微生物逸出地表，由于風(fēng)向使微生物飄向其他地區(qū)，這些微生物附生在農(nóng)作物上，作為細(xì)菌冰核提高了作物細(xì)胞間水分的過冷卻點(diǎn)溫度，致使大規(guī)模霜凍的發(fā)生[48]。筆者認(rèn)為冰凍作為一種大震前兆的應(yīng)用有待于跨領(lǐng)域深入研究，此項(xiàng)研究為震前預(yù)報(bào)提供了很好的研究方向。

4存在的問題及展望

4.1存在的不足

自發(fā)現(xiàn)微生物的冰核現(xiàn)象以來，經(jīng)各國學(xué)者不斷深入研究，在冰核微生物的研究及其應(yīng)用等方面取得較大進(jìn)展，但仍有一些應(yīng)用中的實(shí)質(zhì)性問題未能得到很好的解決。

4.1.1冰核微生物在大氣科學(xué)的研究還不夠深入縱觀冰核微生物的整個(gè)研究發(fā)展過程，相關(guān)的主流研究集中在對其生物學(xué)特性研究、防霜技術(shù)的應(yīng)用、食品冷凍、冰核基因?qū)爰敖档臀镔|(zhì)過冷卻點(diǎn)等方面，遠(yuǎn)遠(yuǎn)偏離了大氣科學(xué)，直到21世紀(jì)初，科學(xué)家們開始再次關(guān)注冰核細(xì)菌的冰核活性，將其應(yīng)用研究延伸到了大氣科學(xué)領(lǐng)域中，從而產(chǎn)生了一個(gè)新興的綜合學(xué)科交叉研究領(lǐng)域[49]。研究中存在的疑問還很多，具有很多不確定性，比如如何鑒別已發(fā)現(xiàn)的生物冰核種和新種，怎樣直接或間接測定混合相云中的生物冰核數(shù)濃度的空間分布，怎樣確定導(dǎo)致大氣活性生物冰核的數(shù)濃度以及其對環(huán)境因子的影響程度和影響機(jī)制等。探求解釋這些科學(xué)問題需要各學(xué)科間的交叉綜合方法去研究，包括氣象學(xué)、微生物學(xué)和大氣化學(xué)、物理學(xué)等。

4.1.2冰核微生物是否對霧霾的形成有誘導(dǎo)作用霧霾成分復(fù)雜，受其粒徑、來源、所處氣候條件等因素影響，主要包括有機(jī)物、無機(jī)物、水溶性無機(jī)鹽以及含碳組分，其中水溶性無機(jī)鹽和含碳組分是霧霾主要組分，其質(zhì)量之和超過霧霾質(zhì)量的50%，且不同時(shí)間不同地區(qū)的霧霾中的無機(jī)元素種類和含量各不相同[50]。霧霾中還含有大量的微生物，如細(xì)菌、病毒、霉菌等[51-53]。近日，清華大學(xué)生命學(xué)院朱聽研究員課題組報(bào)道了北京市霧霾天氣中大氣懸浮顆粒物的微生物組分，其中包含 1 300 多種微生物，細(xì)菌占80%以上，同時(shí)還含有少量的病毒和古細(xì)菌。霧霾具有季節(jié)性日變化模式：整體上是冬季夜間質(zhì)量濃度高于白天，夏季白天質(zhì)量濃度低于夜晚。He等研究發(fā)現(xiàn)霧霾濃度具有明顯的季節(jié)變化特征，即冬季濃度值最高，夏季最低[54]，這與冰核細(xì)菌的分布消長動(dòng)態(tài)相吻合。筆者認(rèn)為低溫是誘導(dǎo)霧霾形成的必要因素之一，霧霾的產(chǎn)生是否受到冰核微生物在相對低溫條件下的叢聚膠黏作用，使大氣中水、無機(jī)物、有機(jī)質(zhì)以及各種污染物聚合在一起而誘導(dǎo)其形成？目前還未見相關(guān)的研究和報(bào)道。

4.1.3應(yīng)加強(qiáng)極地冰核微生物的研究與開發(fā)嚴(yán)寒是極地基本的氣候特征之一，在內(nèi)陸青藏高原也常年分布著高原雪山與凍土層，其分布的冰核微生物還未深入研究。目前，已經(jīng)從南極分離到11株具有冰核活性的細(xì)菌，其中包括一種新的南極細(xì)菌，定名為Pseudomonas sp. KS-1[55]。且與中溫冰核活性生物相比，南極冰核生物具有熱穩(wěn)定性好、冰核活性強(qiáng)、分布廣和致病性弱等特點(diǎn)[56]。加強(qiáng)對極地冰核微生物的研究與開發(fā)將有助于冰核微生物大規(guī)模應(yīng)用邁上新臺(tái)階。

4.1.4應(yīng)加強(qiáng)對真菌冰核的研究真菌冰核基礎(chǔ)理論研究目前還不深入，其具有的獨(dú)特特性是細(xì)菌冰核所不具備的，如耐酸堿、耐熱，不需脂類、糖類和巰基基團(tuán)參與即可發(fā)揮活性等，真菌冰核的應(yīng)用更具便利性、操作性，預(yù)計(jì)應(yīng)用前景可能會(huì)更廣闊，因此，應(yīng)當(dāng)加速真菌冰核的研究和開發(fā)應(yīng)用。

4.1.5在食品工業(yè)應(yīng)用中存在的不足將冰核活性細(xì)菌應(yīng)用于食品的冷凍濃縮中不僅可促使冰晶的生成，降低食品的過冷卻點(diǎn)，還可解決因食品黏度大影響固液分離效率等技術(shù)難題，這也是該技術(shù)將來研究的方向之一，細(xì)菌冰核在食品中的應(yīng)用將日益廣泛?？寺”嘶虿?dǎo)入到乳酸桿菌、酵母菌等食用級(jí)安全微生物中，通過直接應(yīng)用這些微生物而表達(dá)冰核活性，需要對冰核細(xì)菌作大量的分子生物學(xué)研究。如何確保在食品工業(yè)中冰核活性蛋白的高水平表達(dá)和冰核細(xì)菌活性成分對環(huán)境以及人類的安全的影響是當(dāng)前研究的方向。

4.2冰核微生物應(yīng)用前景展望

隨著低溫生物技術(shù)的發(fā)展與改進(jìn)，冰核微生物將越來越顯現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，它除了應(yīng)用在冰核蛋白表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建、食品業(yè)、體育娛樂業(yè)、農(nóng)業(yè)、人工影響氣候演變、促進(jìn)降雨降雪、分子生物學(xué)等領(lǐng)域，還將在醫(yī)藥衛(wèi)生業(yè)昂貴生物制品的保藏等方面起著重要的作用，隨著新的冰核微生物的發(fā)現(xiàn)和對冰核微生物基礎(chǔ)理論研究工作的推進(jìn)以及與不同學(xué)科間的交叉研究，必將使冰核微生物的應(yīng)用前景越來越廣闊，也必將使冰核微生物更廣泛地應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中。

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