崔東亞　楊美玲

摘要：動植物細胞內(nèi)都存在大量的microRNA（miRNA），miRNA的功能之一是通過互補指導(dǎo)內(nèi)切酶切割與之互補的mRNA，對該mRNA進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。但miRNA與靶基因之間并不是完全互補，所以通過序列計算方式預(yù)測的靶基因中假陽性也是很高的。單獨驗證預(yù)測的靶基因不能確定是否正確且費時費力，高通量測序與計算預(yù)測結(jié)合可以很好地驗證和發(fā)現(xiàn)miRNA的靶基因。介紹了尋找miRNA靶基因的降解組測序方法，包括降解組測序的方法原理、試驗流程、miRNA靶基因?qū)ふ业戎饕h(huán)節(jié)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，降解組測序已經(jīng)成為尋找miRNA靶基因的常用方法。

關(guān)鍵詞：降解組；miRNA；靶基因；剪切位點；研究進展

中圖分類號： Q754 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0056-04

收稿日期：2013-10-26

作者簡介：崔東亞（1978—），男，河北滿城人，碩士，講師，主要從事分子生物教學(xué)與研究。E-mail：dongyacui@163.com。microRNAs（miRNAs）是一類具有特殊功能的小RNA，約為22個核苷酸，具有抑制蛋白質(zhì)編碼基因的功能[1]，一些莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA在核酸酶的作用下將莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA剪切加工成miRNA。成熟的miRNA與argonaute（AGO）蛋白結(jié)合形成沉默復(fù)合體，miRNA與靶基因互補，AGO蛋白則催化剪切靶基因，抑制靶基因翻譯蛋白質(zhì)[2]。

在動物體內(nèi)RNA剪切活性來自argonaute2 （AGO2），在5′剪切片段留下3′末端羥基（3′—OH），在3′剪切片段留下5′末端單磷酸（5′—p）[3-4]，但是在動物體內(nèi)已證實的miRNA的靶基因還很少[5-6]。盡管如此，人工構(gòu)建的siRNA（small interfering RNAs）同樣可以依據(jù)miRNA類似的機制，將靶基因沉默，目前已經(jīng)成為研究靶基因功能的常用試驗技術(shù)。

動物的miRNA通常只有部分序列是可以與靶基因完美互補配對的，這段完美互補配對的序列通常是miRNA的第2個至第7個堿基，miRNA中這段與靶基因完全互補的序列為“種子序列”[7-8]。miRNA的3′非種子端序列在一定程度上有增強miRNA對靶基因識別的作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，一些非miRNA靶基因也含有1個或多個miRNA結(jié)合區(qū)域，為了避免非miRNA靶基因也被miRNA剪切，對非miRNA靶基因的保護機制也發(fā)生了進化[9-10]，但是當(dāng)導(dǎo)入1個siRNA/miRNA或敲除1個內(nèi)源miRNA仍然可以引起很多基因表達變化，這些表達變化的基因中包含miRNA剪切的靶基因[11-13]。

植物中miRNA靶基因研究相對比較多，因為miRNA與靶基因互補的現(xiàn)象非常多，且miRNA切割位點比較固定，通常位于mRNA-miRNA互補區(qū)域，從miRNA 5′端算起，切割位點位于第10個和第11個核苷酸之間[14-15]。miRNA調(diào)控靶基因的方式也很多，1個miRNA可以調(diào)控多個靶基因，同時多個miRNA也可以調(diào)控同一靶基因?？傊谘芯縨iRNA功能過程中尋找和鑒定miRNA的靶基因非常有必要。

新一代測序可以一次性測定百萬級的序列，也可以根據(jù)不同需要測定特定類型的RNA，是研究轉(zhuǎn)錄組表達和表達調(diào)控革命性的技術(shù)革新[11]。近幾年，新一代測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用，如尋找新的miRNA[12]。由于植物中miRNA降解靶基因的機制相對比較清晰，所以新一代測序在分析mRNA降解片段中應(yīng)用較多。借助于高通量測序分析miRNA靶基因的植物有擬南芥、玉米、棉花、草莓、番茄、葡萄、黃瓜、楊樹、紅豆杉、蝴蝶蘭和線蟲等眾多物種[13-23]。

如何獲得miRNA及其降解位點是研究miRNA功能的前提。miRNA通過互補方式識別靶基因，并將靶基因切割。所以，傳統(tǒng)的研究方法是通過計算機預(yù)測和后續(xù)的試驗驗證[5]，在驗證過程中須要獲得mRNA的5′末端序列；常規(guī)方法是通過5′-RACE技術(shù)[24-25]，該技術(shù)首先利用poly（A）分離得到mRNA，去掉mRNA的帽子結(jié)構(gòu)并加1個5′接頭序列，或者直接在mRNA 5′末端加入接頭。根據(jù)接頭序列和oligo（dT）或特定序列，PCR擴增可以獲得mRNA全部或部分序列，通過Sanger測序可以獲得mRNA轉(zhuǎn)錄起始位點序列。通過 5′-RACE 技術(shù)即可以找到mRNA轉(zhuǎn)錄起始序列[26-27]，也可以用于mRNA的切割序列分離[24]。通常通過miRNA預(yù)測靶基因，然后用5′-RACE對預(yù)測的mRNA開展剪切位點研究，即尋找或驗證某個特定的mRNA的5′末端序列。

RACE方法是分析RNA末端的常用方法[24]，新一代測序可以測定百萬條序列[28]。將二者結(jié)合，能一次性測得所有RNA的末端序列，輔以生物軟件分析末端序列，可以同時驗證所有預(yù)測的靶基因[29]。這樣不僅可以大大提高工作效率，而且還可以從降解片段入手尋找新的miRNA[35-36]。

1MmeⅠ內(nèi)切酶和降解組建庫流程

1.1MmeⅠ是降解組測序重要的酶

降解組分析中的關(guān)鍵是如何找到miRNA-AGO復(fù)合物切割的mRNA片段，獲得mRNA切割位點序列，無非是獲得切割位點處的序列。3′切割片段是mRNA切割產(chǎn)物之一，其5′末端是單磷酸結(jié)構(gòu)，3′末端具有poly（A）結(jié)構(gòu)。測定這樣的序列，可以發(fā)現(xiàn)所有被剪切的mRNA序列。但這樣的序列太長，超出了新一代測序技術(shù)的要求。通過化學(xué)方法將序列打斷，又會將切割位點序列淹沒在眾多序列之中，造成背景噪音過大。

MmeⅠ從嗜甲基菌（Methylophilus methylotrophus）中分離得到，屬于Ⅱ型限制性內(nèi)切酶。在非回文DNA序列上，MmeⅠ識別5′-TCCRAC-3′序列 （R 表示 G或 A），在識別位點下游20 bp處將雙鏈DNA切割，并在識別序列留下2個堿基的黏性末端。MmeⅠ的識別序列為5′-TCCRAC（N）20-3′[30]。MmeⅠ可以單一地將DNA的切割序列截取下來，單一測定切割位點序列。所以，MmeⅠ是降解組測序過程中的關(guān)鍵酶。

1.2降解組測序技術(shù)路線

降解組分析主要分成RNA建庫測序與數(shù)據(jù)分析2個部分。其中，RNA建庫是RNA測序前的RNA處理過程。RNA建庫很關(guān)鍵，測序目的不同，RNA建庫方法也不同[31-32]。根據(jù)目的RNA特點，設(shè)計特征的RNA建庫路線，富集獲得感興趣的RNA，即富集目的RNA過程中同時也在去除污染RNA。降解組測序RNA處理過程有別于其他類型的RNA處理，降解組測序RNA處理過程的實質(zhì)是獲得被miRNA切割的 mRNA 產(chǎn)物[33-34]。通常mRNA 5′ 末端具有帽子結(jié)構(gòu)，3′ 端具有poly（A）結(jié)構(gòu)，mRNA被剪切后，形成2種剪切產(chǎn)物，即5′ 剪切片段和3′ 剪切片段。降解組測序就是要提取3′ 剪切片段，3′ 剪切片段的5′ 具單磷酸結(jié)構(gòu)，3′ 末端具有poly（A）結(jié)構(gòu)[34]。根據(jù)3′ 剪切片段特定設(shè)計RNA建庫流程（圖1）。

1.2.1降解組測序基本設(shè)計思路第一，根據(jù)poly（A）尾巴可將所有帶有poly（A）尾巴的RNA分離得到，帶有polyA尾巴的RNA主要有完整的mRNA和3′ 剪切片段2種。第二，在3′ 剪切片段5′ 末端加入RNA接頭。完整的mRNA 5′ 末端為帽子結(jié)構(gòu)，3′ 剪切片段的5′ 末端為單磷酸。只有單磷酸結(jié)構(gòu)的RNA可以與5′ 接頭相連接[35]。5′ 接頭序列帶有MmeⅠ識別位點，如擬南芥降解組分中5′ RNA接頭：5′-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGAC-3′，粗體標(biāo)記為MmeⅠ內(nèi)切酶識別序列[33]。第三，反轉(zhuǎn)錄RNA為DNA。即根據(jù)接頭序列和oligo（dT）將3′ 剪切片段反轉(zhuǎn)錄為雙鏈DNA序列。第四，酶切獲得3′ 剪切片段的5′ 末端序列（即切割位點序列）。因為在接頭序列中預(yù)先引入MmeⅠ識別位點，帶有接頭的序列會被MmeⅠ切割生成40 bp左右的序列（含接頭序列）。第五，在MmeⅠ酶切位點加入DNA接頭。MmeⅠ酶切后，分離酶切序列，在MmeⅠ切割位點處連接雙鏈DNA接頭，如擬南芥雙鏈DNA接頭為5′-TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3′和其互補鏈3′-NNAGCATACGGCAGAAGACGAAC-5′[33]。第六，純化帶有雙鏈DNA接頭的序列，按照新一代測序流程進行測序。

1.2.2降解組測序設(shè)計原理通過mRNA的結(jié)構(gòu)特征、miRNA調(diào)控靶基因特征以及結(jié)合新一代測序技術(shù)來實現(xiàn)。將測序數(shù)據(jù)回帖轉(zhuǎn)錄組，深入比對分析，如果在mRNA序列的某個位點發(fā)現(xiàn)1個回帖比對峰值，該峰值就是候選的 miRNA 剪切位點，于是從試驗中找到了miRNA的作用靶基因。

1.3降解組數(shù)據(jù)分析基本流程

高通量建庫和測序可以交由測序公司負責(zé)處理，因為建庫、測序所需要的試劑和設(shè)備非常昂貴，有公司負責(zé)建庫和測序相對比較便宜，而且現(xiàn)在的降解組測序技術(shù)已經(jīng)非常成熟，國內(nèi)也涌現(xiàn)出多家測序公司，甚至一些大型的科研單位自己就可以直接開展測序服務(wù)。但降解組數(shù)據(jù)分析過程則要求科研人員要熟悉miRNA調(diào)控切割靶基因的基本過程，尤其是具備一定的數(shù)據(jù)處理分析能力。

通過降解組分析可以很輕松地發(fā)現(xiàn)miRNA的降解片段，而且也可以根據(jù)降解片段發(fā)現(xiàn)新的miRNA。降解組數(shù)據(jù)分析基本分為以下幾個過程（圖2）。

1.3.1獲得clean 數(shù)據(jù)所謂clean數(shù)據(jù)是指去除測序接頭序列和低質(zhì)量序列。如果是由公司測序，一般可以直接從測序公司獲得clean數(shù)據(jù)，將clean數(shù)據(jù)直接用于下一步分析。但NCBI上下載的數(shù)據(jù)中有時也有測序的原始數(shù)據(jù)，利用這

些數(shù)據(jù)分析之前則須要進行數(shù)據(jù)預(yù)處理，基本過程包括：去除測序接頭序列、去除簡單重復(fù)序列、去除帶有不確定堿基的序列、測序質(zhì)量分析等。結(jié)合軟件操作可以輕松實現(xiàn)數(shù)據(jù)處理，如FASTQ/A Clipper、cutadapt等。

1.3.2序列比對從miRNA數(shù)據(jù)庫中找到miRNA的序列，與clean數(shù)據(jù)分別與參考基因匹配，分析每種序列和miRNA的匹配位點。編寫腳本程序，找到miRNA匹配位點附近的降解片段。因為降解片段來自mRNA降解，miRNA與mRNA互補，根據(jù)這個特征找到降解片段剪切位置周圍是否有互補miRNA存在。如果存在miRNA，計算miRNA周圍降解片段數(shù)量。序列匹配軟件很多，常用的有BOWTIE[36]、SOAP2[37]、BWA[38]等。

1.3.3獲得靶基因如果miRNA互補區(qū)域內(nèi)存在一個明顯的降解片段峰值，則說明該基因很有可能是與之互補的 miRNA 靶基因，通過與周圍噪音相比，確定該基因為miRNA的疑似靶基因。

1.3.4圖片展示將找到的候選靶基因、miRNA和降解片段位置和數(shù)量，通過圖展示出來，如常用t-plot展示，t-plot展示可采用R語言繪制；也可以用一般作圖軟件實現(xiàn)如 Excel （圖3）。

2結(jié)論與討論

miRNA是一類非常重要的調(diào)控小RNA，通過剪切mRNA來調(diào)控靶基因的功能，達到調(diào)節(jié)生理代謝或發(fā)育的目的。miRNA及其調(diào)控序列的發(fā)現(xiàn)，有助于深入了解miRNA的功能。然而，miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)極其復(fù)雜，miRNA僅僅通過種子的區(qū)域序列就可以達到調(diào)控靶基因的功能，所有mRNA可同時受到多種小RNA的調(diào)控，或同一種小RNA在同一mRNA上有多個的靶位點，這會給降解組分析帶來一定的困難。同時，近年來涌現(xiàn)出來其他類型的小RNA，如22G-RNA、26G-RNA、piRNA等小RNA[39]。這些小RNA是否直接參與mRNA的調(diào)控還不清楚，但果蠅piRNA可以通過與轉(zhuǎn)座子RNA序列互補，指導(dǎo)內(nèi)切酶將轉(zhuǎn)座子RNA切割，阻止轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座。但在線蟲中，piRNA并不直接參與靶基因的沉默，而是誘導(dǎo)次級小RNA 22G-RNA生成，這些次級22G-RNA調(diào)控互補序列沉默，22G-RNA是否直接參與靶基因的切割還不清楚。但有研究發(fā)現(xiàn)，一些次級siRNA也可以切割靶基因[40]。小RNA如何調(diào)控靶基因一直是研究的熱點之一，其中小RNA參與靶基因的切割是研究的一個方向?，F(xiàn)在有多個網(wǎng)站提供miRNA靶基因的預(yù)測服務(wù)[5，41-43]，但預(yù)測的結(jié)果需要試驗驗證。理論上降解組測序幾乎可以一次性驗證所有預(yù)測的靶基因，可以將預(yù)測的靶基因從試驗角度加以證實。降解組測序?qū)嵸|(zhì)是測定具有一定特征的RNA 5′ 末端序列，這類RNA特征是5′ 末端具有單磷酸且3′末端具有 poly（A）[34]。這類RNA可以是來自miRNA指導(dǎo)的mRNA切割產(chǎn)物，也可以是來自mRNA的分解產(chǎn)物[44]。當(dāng)miRNA的靶基因表達量不高或mRNA分解產(chǎn)物過高時，非特異性的 mRNA 降解片段容易檢測到，背景噪音過高，會對miRNA靶基因分析帶來困難。但測序技術(shù)也在不斷提高，相應(yīng)分析方法也在升級，高通量測序與數(shù)據(jù)分析技術(shù)已經(jīng)成為生物試驗中的常規(guī)試驗檢測分析方法。

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