響應(yīng)面法優(yōu)化杏鮑菇下腳料多糖提取工藝

張 慶，林 凱，袁春紅，李 可，肖 奎，向文良

(1. 西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2. 成都榕珍菌業(yè)有限公司，四川 成都 611733)

杏鮑菇(Pleurotuseryngii)又名刺芹側(cè)耳，隸屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、真擔(dān)子菌綱、層菌亞綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬，是一種珍貴的藥食皆宜的真菌。藥用功效研究發(fā)現(xiàn)，杏鮑菇可顯著提高人體免疫功能，并有抗癌、降血脂、潤腸胃、美容的功效[1-5]。其多糖作為一種特殊的免疫調(diào)節(jié)劑，在激活T淋巴細胞中具有強烈的宿主介導(dǎo)性，能刺激抗體形成、增強機體免疫力、發(fā)揮抗癌作用[3]。杏鮑菇多糖成分對自由基引起的亞油酸、菜油氧化以及離體肝臟組織的脂質(zhì)過氧化均有一定的抑制作用[4-5]。

目前，已有學(xué)者對杏鮑菇子實體、菌絲體及杏鮑菇菌糠廢棄物多糖的提取工藝進行了研究[1, 5, 6-13]，而從杏鮑菇加工過程中產(chǎn)生的下腳料中提取多糖的研究還未見報道。杏鮑菇加工廢棄物下腳料大多產(chǎn)生于子實體部位，含有豐富的多糖成分，與子實體多糖具有相似的生物學(xué)活性和生理功能。從杏鮑菇加工廢棄物下腳料中提取多糖，不僅可以延伸杏鮑菇產(chǎn)業(yè)鏈，提高產(chǎn)品附加值，還可減少廢棄物丟棄造成的環(huán)境污染，促進杏鮑菇產(chǎn)業(yè)向多元化良性發(fā)展，提高企業(yè)經(jīng)濟效益和生態(tài)效益有重要促進作用。本實驗主要探討了熱水浸提溫度、提取時間及液料比對杏鮑菇下腳料多糖提取率的影響，利用Box-Behnken響應(yīng)面分析法對多糖提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，獲得杏鮑菇廢棄物下腳料多糖提取的最佳工藝條件，為杏鮑菇加工廢棄物下腳料的進一步應(yīng)用開發(fā)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏鮑菇下腳料，四川榕珍菌業(yè)有限公司；無水葡萄糖、濃硫酸、苯酚，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ZN-200A高速中藥粉碎機，長沙市岳麓區(qū)中南制藥機械廠；YLD-2000型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；TB-214型電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠；WTL超微臺式離心機，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；UV-2600型紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

杏鮑菇下腳料鮮品，清洗除雜，切成片狀，60 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥至恒重，粉碎，過40目篩。按液料比8∶1(mL/g)加入無水乙醇，浸泡24 h， 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，去脂后殘渣置于陰涼處風(fēng)干，粉碎，過60目篩，于真空干燥器保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 杏鮑菇下腳料多糖提取工藝路線

杏鮑菇下腳料(1.000 g)→熱水浸提(不同因素)→離心2次→取上清液→定容→取上清液(稀釋)→苯酚-硫酸法測定粗多糖提取率。

1.3.3 標準曲線制作

用苯酚-硫酸法測定多糖含量的標準曲線[5]。標準曲線以無水葡萄糖為標準品，于490 nm 波長處測定吸光度，以糖質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，并求出標注曲線回歸方程。

1.3.4 杏鮑菇下腳料多糖提取單因素試驗設(shè)計

分別考察提取溫度、時間和液料比對多糖提取率的影響。

1.3.5 杏鮑菇下腳料多糖提取中心組合試驗設(shè)計

在對提取溫度、浸提時間、液料比3個進行單因素試驗的基礎(chǔ)上，以杏鮑菇下腳料多糖提取率為響應(yīng)值，運用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計方案，采用三因素三水平響應(yīng)面分析法進行試驗。實驗數(shù)據(jù)依據(jù)Design-expert 7.0統(tǒng)計軟件回歸分析確定各提取條件的影響因子，繪制響應(yīng)面與等值線圖，分析確定杏鮑菇下腳料多糖的最佳提取條件。

1.3.6 杏鮑菇下腳料多糖提取率

多糖提取率/%=

(1)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取溫度對杏鮑菇下腳料多糖提取率的影響

準確稱取5份0.20 g杏鮑菇下腳料干粉，各加入5 mL蒸餾水，搖勻，水浴加熱，加熱溫度分別為75、80、85、90、95 ℃，浸提4 h，冷卻，6 000 r/min離心10 min，收集上清液，加去離子水定容至一定體積，測定其中多糖質(zhì)量濃度，計算多糖提取率，結(jié)果見圖1。

圖1 提取溫度對多糖提取率的影響

由圖1可知，隨著溫度的上升，杏鮑菇下腳料多糖的提取率增加，當溫度達到85 ℃后，多糖提取率隨著溫度的升高沒有明顯增加，綜合溫度過高能耗增加及水分揮發(fā)過多等因素考慮，選擇85 ℃為適宜的多糖提取溫度。

2.1.2 提取時間對杏鮑菇下腳料多糖提取率的影響

準確稱取5份0.20 g杏鮑菇下腳料干粉，各加入5 mL蒸餾水，搖勻，85 ℃水浴分別加熱1、2、3、4、5 h，冷卻，6 000 r/min離心10 min，收集上清液，加去離子水定容至一定體積，測定其中多糖質(zhì)量濃度，計算多糖提取率，結(jié)果見圖2。

圖2 提取時間對多糖提取率的影響

由圖2可知，隨著浸提時間的延長，杏鮑菇子實體多糖的提取率在不斷的增加，3 h時的多糖提取率最大；此后，隨著時間的延長，多糖提取率趨于穩(wěn)定，無顯著變化，因此從節(jié)約提取時間，降低提取成本角度考慮，選擇適宜的提取時間為3 h左右。

2.1.3 液料比對杏鮑下腳料多糖提取率的影響

準確稱取5份0.20 g杏鮑菇下腳料干粉，研究85 ℃水浴浸提3 h條件下，不同液料比對多糖提取率的影響，結(jié)果見圖3 。

圖3 提取液料比對多糖提取率的影響

由圖3可知，開始階段，隨著液料比的增加，杏鮑菇下腳料多糖的提取率不斷增加，當液料比達25∶1時提取率最大；而當液料比繼續(xù)增加時，杏鮑菇下腳料多糖提取率開始下降，因此，25∶1為適宜的液料比。

2.2 響應(yīng)面試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

在單因素試驗考察結(jié)果的基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Behnken 中心組合試驗設(shè)計原理，選取液料比、提取溫度和時間3個因素為自變量，杏鮑菇下腳料多糖提取率(Y)為響應(yīng)值，設(shè)計了一個三因素三水平共17個試驗點的響應(yīng)面優(yōu)化分析試驗。響應(yīng)面試驗因素水平編碼值見表1，結(jié)果見表2。

表1 試驗因素及水平表

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計和結(jié)果

將表2所得的試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合分析，回歸模型系數(shù)及顯著性檢驗結(jié)果見表3。3個考察因素經(jīng)回歸分析后得到以杏鮑菇下腳料多糖提取率(Y)為目標函數(shù)的二次回歸方程

Y=8.66+0.12X1+0.38X2+0.44X3+0.17X1X2+0.090X1X3-0.15X2X3-0.51X12-0.36X22-0.40X32

表3 回歸模型系數(shù)及顯著性檢驗結(jié)果

續(xù)表3方差來源平方和自由度均方F值P值顯著性X1 X20.108 910.108 95.042 30.059 6X1 X30.032 310.032 31.497 20.260 7X2 X30.089 710.089 74.1520.081 0X121.077 411.077 449.8730.000 2??X220.544 310.544 325.1930.0015??X320.671 310.671 331.0720.000 8??剩余項0.151 270.021 6失擬項0.086 330.028 81.770.291 7純誤差0.06540.016 2總差5.776 216相關(guān)系數(shù)(R2)R2=0.973 8

注：P值是方差齊性檢查的結(jié)果; ** 表示極顯著水平(P<0.01); * 表示顯著水平(0.01

由回歸模型方差分析可知，該回歸模型P值<0.000 1，極顯著，表明該模型能夠正確預(yù)測杏鮑菇下腳料多糖提取率與各考察因素之間的關(guān)系。該模型的失擬項P(0.291 7)>0.05，不顯著，表明無其他因素顯著影響該實驗，該回歸模型與實際實驗擬合較好，試驗誤差小。相關(guān)系數(shù)R2=0.973 8，表明采用響應(yīng)面法設(shè)計所得的回歸模型有效，適用于杏鮑菇下腳料多糖提取實驗的理論預(yù)測。

2.2.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)曲面及等高線圖能夠直觀地反映各個因素及其交互作用，利用Design Expert軟件即可以作出2因素交互作用的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖，結(jié)果見圖4。

(a)液料比(X1)和溫度(X2)

(b)液料比(X1)和時間(X3)

(c)溫度(X2)和時間(X1)

從圖4可以看出，在所選的范圍內(nèi)存在極值，既是響應(yīng)面的最高點，同時也是等高線最小橢圓的中心點。圖4(a)顯示了提取溫度和液料比對多糖提取率的交互效應(yīng)，由圖4(a)可知，等高線沿作用溫度軸變化較液料比軸向變化相對密集，曲面較陡，說明溫度對杏鮑菇下腳料多糖提取率的影響較顯著。圖4(b)顯示了提取時間和液料比對多糖提取率的交互效應(yīng)，由圖4(b)可知，等高線沿液料比軸向變化相對稀疏，而沿提取時間軸向變化更密集，說明時間較液料比對響應(yīng)值的影響更大。圖4(c)顯示了提取溫度和時間對多糖提取率的交互效應(yīng)，從其等高線圖可以看出該2個因素的交互作用不大，在編碼值為0以上的提取溫度在提取時間一定范圍內(nèi)都能夠得到較大的響應(yīng)值。

2.2.3 最優(yōu)化工藝條件的確定

對二次回歸方程分析，可得最優(yōu)化的杏鮑菇下腳料多糖提取條件為：液料比26.2 mL/g，溫度87.4 ℃，時間3.245 h。在該條件下由響應(yīng)面模型預(yù)測理論提取率為Y=8.87%。為檢驗響應(yīng)面優(yōu)化法的可靠性，考慮實驗室試驗條件，采用液料比26 mL/g、溫度87 ℃、時間3.2 h的修正條件進行平行試驗，結(jié)果得出杏鮑菇下腳料多糖的實際提取率為8.76 %，與模型理論預(yù)測值基本吻合，說明，該響應(yīng)面回歸模型具有可行性。

3 結(jié)論

在單因素試驗的考察基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法建立影響因素的二次回歸模型，對數(shù)據(jù)進行分析，得到杏鮑菇下腳料多糖的提取最佳工藝參數(shù)為液料比26 mL/g、提取溫度87 ℃、提取時間3.2 h，多糖的提取率為8.76 %。

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