徐 希 陳衛(wèi)昌 朱一凡 錢(qián)夷婷

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科(215006)

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族是一組具有降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)功能的蛋白酶類(lèi)，被認(rèn)為與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)[1-2]。MMP-9屬于明膠酶類(lèi)，又名明膠酶B(gelatinase B)，是MMPs家族的重要成員。而中性粒細(xì) 胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)是在研究MMP-9時(shí)發(fā)現(xiàn)的小分子蛋白，是脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(lipocalin)家族的新成員，可與MMP-9結(jié)合形成復(fù)合物，阻止MMP-9降解以維持其酶活性[3]。既往研究顯示MMP-9過(guò)表達(dá)與多種惡性腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4-5]。本研究采用ELISA方法檢測(cè)胃癌患者的血清MMP-9、NGAL水平，旨在初步探討兩者在胃癌患者外周血中的變化及其臨床意義。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

選擇2012年5月-2013年5月在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診的胃癌患者76例，其中男56例，女20例，年齡32～88歲，平均(62.89±9.55)歲。入選患者胃癌診斷經(jīng)胃鏡活檢或手術(shù)病理證實(shí)，均為初治患者，之前未接受過(guò)放化療以及其他抗腫瘤治療，均簽署知情同意書(shū)。其中65例患者接受手術(shù)治療，臨床和病理資料完整，術(shù)后病理均為腺癌，分期采用2010年UICC/AJCC胃癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。另選取同期健康體檢者50名作為正常對(duì)照組，其中男34例，女16例，年齡34～72歲，平均(55.27±12.03)歲，無(wú)心、肺、肝、腎等重要臟器疾病，無(wú)系統(tǒng)性炎癥性疾病，無(wú)全身急慢性感染性疾病，肝腎功能正常。研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。胃癌組與正常對(duì)照組間性別構(gòu)成、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、方法

抽取受試者清晨空腹外周靜脈血5 mL，EDTA抗凝，室溫靜置1 h，4 360×g離心5 min，小心吸取上層血清，置于干燥潔凈凍存管中，-80 ℃保存待測(cè)。MMP-9、NGAL濃度檢測(cè)采用ELISA方法，試劑盒購(gòu)自上海依科賽生物制品有限公司，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算血清MMP-9、NGAL濃度。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、血清MMP-9、NGAL水平及其與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

胃癌組血清MMP-9、NGAL水平均明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。進(jìn)一步分析65例接受手術(shù)治療者的血清MMP-9、NGAL水平與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)不同TNM分期胃癌患者間的MMP-9、NGAL水平總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中Ⅰ+Ⅱ期MMP-9水平顯著低于Ⅲ期和Ⅳ期(P=0.002,P=0.026)，Ⅲ、Ⅳ期間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.852)；Ⅳ期NGAL水平顯著高于Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ期(P=0.005,P=0.012)，Ⅰ+Ⅱ期與Ⅲ期間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.495)。此外，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者、腫瘤浸潤(rùn)突破漿膜層者血清MMP-9水平分別顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者和未突破漿膜層者，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者血清NGAL水平顯著高于無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者。腫瘤分化程度與血清MMP-9、NGAL水平均無(wú)關(guān)(表2)。

表1 兩組血清MMP-9、NGAL水平比較

二、相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示，胃癌患者的血清MMP-9、NGAL水平均與腫瘤TNM分期呈顯著正相關(guān)(P=0.010,rs=0.318;P=0.008,rs=0.328)，血清MMP-9與NGAL水平之間則無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系(P=0.235,r=0.138)。

三、血清MMP-9、NGAL篩查胃癌的診斷性能

繪制血清MMP-9、NGAL篩查胃癌的ROC曲線(xiàn)(圖1)，兩者曲線(xiàn)下面積(AUC)分別為0.832和0.942。MMP-9的最佳臨界值為608.19 ng/mL，相應(yīng)敏感性和特異性分別為64.5%和90.0%；NGAL的最佳臨界值為14.71 ng/mL，相應(yīng)敏感性和特異性分別為85.5%和90.0%。如采用并聯(lián)試驗(yàn)，兩者聯(lián)合檢測(cè)的敏感性和特異性分別為 94.7%和82.0%。

討 論

胃癌是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其發(fā)生、發(fā)展是多種因素共同作用的復(fù)雜過(guò)程。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的生物學(xué)特征，也是患者死亡的主要原因。腫瘤細(xì)胞突破基底膜是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，因此腫瘤細(xì)胞必須具備降解ECM的能力， 才能向周?chē)M織浸潤(rùn)并侵入血管、 淋巴管向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，MMPs家族成員通過(guò)介導(dǎo)ECM降解，在此步驟中起至關(guān)重要的作用[1-2]。MMP-9由Sopata和Dancewicz于1974年在中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，其能降解Ⅳ、Ⅴ型膠原和Ⅰ、Ⅴ型明膠，破壞基底膜完整性，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，MMP-9過(guò)表達(dá)已被證實(shí)與乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4-5]。此外，MMP-9尚可參與腫瘤血管生成，其機(jī)制與降解血管基底膜和周?chē)g質(zhì)以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的合成和釋放有關(guān)[6]。

表2 胃癌患者血清MMP-9、NGAL水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

圖1 血清MMP-9、NGAL篩查胃癌的ROC曲線(xiàn)

本研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者的血清MMP-9水平顯著高于健康人，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，腫瘤浸潤(rùn)突破漿膜層者顯著高于未突破漿膜層者，晚期胃癌(Ⅲ、Ⅳ期)顯著高于早期胃癌(Ⅰ、Ⅱ期)。Kabashima等[7]發(fā)現(xiàn)癌組織MMP-9表達(dá)與黏膜內(nèi)胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴管彌散顯著相關(guān)；Torii等[8]發(fā)現(xiàn)胃癌患者術(shù)前血漿MMP-9水平顯著增高并與腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和pTNM分期密切相關(guān)，術(shù)后MMP-9水平顯著降低；Sier等[9]的研究則提示胃癌組織中MMP-9高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)，可作為胃癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。綜合本研究以及上述研究結(jié)果，血清MMP-9水平與癌組織MMP-9表達(dá)一樣可反映胃癌的侵襲、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，是值得重視的胃癌監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

MMPs/TIMPs(MMPs組織抑制劑)是維持ECM動(dòng)態(tài)平衡的重要環(huán)節(jié)，決定了ECM的降解程度，兩者活性失衡可促進(jìn)惡性腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。NGAL是Kjeldsen等[10]在1993年分離、純化得到的與人MMP-9結(jié)合的蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為25 kDa(1 Da=0.992 1 u)，可拮抗TIMP-1對(duì)MMP-9的抑制作用以維持其活性，促進(jìn)ECM降解。在腫瘤細(xì)胞微環(huán)境中，最早出現(xiàn)的變化是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，研究[11]表明NGAL可通過(guò)EMT關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Slug誘導(dǎo)EMT，進(jìn)而促進(jìn)某些腫瘤細(xì)胞(如人乳腺癌細(xì)胞)遷移和侵襲，參與腫瘤進(jìn)展。而在另一些腫瘤細(xì)胞中(如4T1-Ras-轉(zhuǎn)化腫瘤細(xì)胞)，NGAL則可逆轉(zhuǎn)EMT(即誘導(dǎo)間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化)，表現(xiàn)為抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。在高轉(zhuǎn)移性和低轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌細(xì)胞株中，NGAL表達(dá)與細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能呈負(fù)相關(guān)，在高轉(zhuǎn)移性、低NGAL表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)NGAL能顯著抑制其侵襲和肝轉(zhuǎn)移[13]。此外，NGAL在腫瘤組織中的表達(dá)有明顯異質(zhì)性，如在肺、結(jié)腸、胰腺癌中高表達(dá)，在腎、前列腺癌中低表達(dá)，淋巴和胸腺腫瘤不表達(dá)NGAL[14]。NGAL在不同類(lèi)型腫瘤和細(xì)胞株中對(duì)侵襲、轉(zhuǎn)移的不同影響可能與激活不同信號(hào)通路有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者的血清NGAL水平顯著高于健康人，其中有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者顯著高于無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者，且隨TNM分期進(jìn)展而增高，提示NGAL參與促進(jìn)胃癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。Kubben等[15]的研究顯示胃癌組織中的MMP-9/NGAL復(fù)合物表達(dá)與Lauren分型、WHO分型和預(yù)后不良顯著相關(guān)。上述結(jié)果提示檢測(cè)胃癌患者的血清NGAL水平對(duì)胃癌的預(yù)后評(píng)估可能有一定價(jià)值。盡管NGAL與MMP-9在功能上存在一定聯(lián)系，但本研究相關(guān)性分析卻未提示胃癌患者中兩者的血清水平存在相關(guān)關(guān)系，可能與不同胃癌患者的NGAL表達(dá)存在異質(zhì)性有關(guān)。

由于多種惡性腫瘤患者均存在血清MMP-9、NGAL表達(dá)異常，故其檢測(cè)對(duì)胃癌診斷缺乏特異性，但作為胃癌高危人群的篩查指標(biāo)可能仍有一定價(jià)值。本研究應(yīng)用ROC曲線(xiàn)評(píng)價(jià)了血清MMP-9、NGAL篩查胃癌的診斷性能，結(jié)果顯示取最佳臨界值時(shí)，兩者的敏感性分別為64.5%和85.5%，特異性均為90.0%，如采用并聯(lián)試驗(yàn)，敏感性可提高至94.7%，特異性則略有降低(82.0%)。鑒于血清MMP-9、NGAL水平均隨胃癌TNM分期進(jìn)展而增高，與TNM分期間存在顯著正相關(guān)關(guān)系，故亦可考慮作為判斷胃癌進(jìn)展和預(yù)后的血清學(xué)指標(biāo)。

綜上所述，MMP-9、NGAL在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，兩者在胃癌患者中的血清水平顯著增高并與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，可能作為胃癌篩查、病情判斷和預(yù)后評(píng)估的潛在指標(biāo)。由于本研究樣本量小、時(shí)間跨度短，研究結(jié)論尚需擴(kuò)大樣本量、完善隨訪(fǎng)并開(kāi)展多中心臨床試驗(yàn)以進(jìn)一步驗(yàn)證。

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