李 霞 徐桂芳 張偉杰 周志華 郭 明 鄒曉平

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化內(nèi)科1(210008) 急診外科2解放軍第101醫(yī)院病理科3 南京中醫(yī)藥大學(xué)4

腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSCs)是指一類存在于腫瘤內(nèi)部，具有自我更新和腫瘤形成能力的細胞，可進一步“分化”形成腫瘤細胞，是腫瘤增殖生長、侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及化療耐藥的根源[1]，CSCs已成為當(dāng)前腫瘤研究的熱點之一。胃癌干細胞(gastric cancer stem cells, GCSCs)于近年在胃癌細胞株、原發(fā)腫瘤組織和患者外周血中被鑒定，表面標(biāo)記物CD44可作為識別GCSCs的標(biāo)記[2-3]，其他干細胞標(biāo)記物如CD54以及胃壁細胞標(biāo)記物H+/K+-ATPase亦被用于識別GCSCs[3-4]。然而迄今為止，GCSCs的特性尚未得到很好的研究。本實驗采用懸浮培養(yǎng)法從人胃癌細胞株中分離GCSCs樣細胞，以CD44、CD54和H+/K+-ATPase免疫熒光標(biāo)記進行鑒定，并觀察GCSCs富集的腫瘤球的自我更新和增殖、遷移、侵襲能力以及對順鉑的耐藥性，旨在加深對GCSCs干細胞特性的認識，為其“干性”研究提供新的實驗依據(jù)。

材料與方法

一、細胞株和主要試劑

人胃癌細胞株MKN45、MGC803、SGC7901由南京市鼓樓醫(yī)院消化內(nèi)科實驗室保存。RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM/F-12培養(yǎng)基、FBS(Wisent Inc.)，表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)(PeproTech)，CD44、CD54、H+/K+-ATPase抗體(Merck Millipore)，DyLight 488 AffiniPure綠色熒光二 抗(Abbkine, Inc.)，Transwell小室(Corning Costar?)，CCK-8試劑盒(Dojindo Molecular Technol-ogies, Inc.)，順鉑(南京市鼓樓醫(yī)院)。

二、方法

1. 胃癌細胞和腫瘤球培養(yǎng)：MKN45、MGC803、SGC7901細胞常規(guī)使用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別將2×105MKN45、MGC803、SGC7901細胞懸浮培養(yǎng)于干細胞培養(yǎng)基(含20 μg/L EGF、10 μg/L bFGF、不含血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基)中，每5 d機械分離一次培養(yǎng)形成的腫瘤球以除去球中心凋亡細胞，即將腫瘤球離心并轉(zhuǎn)移至含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)3 h，然后再次懸浮培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基中，由此得到第二代、第三代懸浮的腫瘤球。以下各步驟實驗均使用對數(shù)生長期胃癌細胞，各實驗步驟均設(shè)3個復(fù)孔或重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

2. 集落形成實驗：取胃癌細胞及其第三代貼壁后腫瘤球，含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，以200/孔接種于加入適量含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基的6孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)2周，結(jié)晶紫染色，計數(shù)超過50個細胞的克隆集落。

3. 免疫熒光法檢測GCSCs標(biāo)記物：取胃癌細胞及其第三代貼壁后腫瘤球，EDTA-胰蛋白酶消化，制成5×104/mL單細胞懸液，接種于加入適量含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基的24孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)過夜以誘導(dǎo)分化。次日取出細胞至室溫，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗滌，10%山羊血清封閉1 h，分別標(biāo)記兔抗人CD44(1∶100)、鼠抗人CD54(1∶100)、山羊抗人H+/K+-ATPase(1∶200)抗體，4 ℃過夜，加入二抗(DyLight 488標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗鼠、兔抗山羊IgG，1∶50)，室溫孵育1 h，DAPI標(biāo)記細胞核，熒光顯微鏡下觀察。

4. 細胞劃痕實驗：以Marker筆在6孔板背后借助直尺均勻劃橫線，每隔0.5～1 cm一道，橫穿過孔，每孔至少穿過5條橫線。取胃癌細胞及其第三代貼壁后腫瘤球，EDTA-胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，每孔加入約5×105個細胞，次日以100 μL槍頭借助直尺盡量垂直于背后橫線劃痕，PBS洗滌3次以除去劃下的細胞，加入含1%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別于0 h、24 h時取樣、拍照。

5. 細胞侵襲實驗：于Transwell小室上室面涂布Matrigel基質(zhì)膠。取胃癌細胞及其第三代貼壁后腫瘤球，EDTA-胰蛋白酶消化，以無血清RPMI 1640培養(yǎng)基制成1×105/mL單細胞懸液，于上室中加入200 μL懸液，下室中加人600 μL含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。取出小室，以棉簽拭去上室面未侵襲細胞，PBS洗滌，結(jié)晶紫染色10 min，清洗風(fēng)干，光學(xué)顯微鏡下觀察、計數(shù)膜背面侵襲細胞(穿膜細胞)，計數(shù)中央和四周共5個視野(×400)，結(jié)果取均值。

6. CCK-8實驗：取SGC7901細胞及其第三代貼壁后腫瘤球，EDTA-胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，以5 000/孔接種于96孔板，每孔100 μL，24 h細胞貼壁后實驗組每孔加入100 μL順鉑溶液，終濃度分別為0.01、0.1、1、10、100 μg/mL，對照組加入100 μL培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。各組細胞培養(yǎng)不同時間后自培養(yǎng)箱中取出，每孔加入CCK-8 10 μL，孵育1 h，使用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處吸光度(A)值。細胞生長抑制率= (A對照組-A實驗組)/(A對照組-A空白組)×100%。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、胃癌細胞腫瘤球形成和自我更新、增殖能力

于無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)5 d后，3株人胃癌細胞均具有形成腫瘤球體的能力，同時大部分懸浮細胞發(fā)生凋亡，形成外觀松散的第一代腫瘤球，而隨后的第二、第三代腫瘤球外觀逐漸變得致密(圖1)，數(shù)量亦逐漸增多，提示GCSCs富集。集落形成實驗顯示，腫瘤球形成的克隆集落體積和數(shù)量均大于普通胃癌細胞(圖2A、2B)，表明GCSCs富集的腫瘤球克隆形成能力較普通胃癌細胞強。

二、胃癌細胞腫瘤球GCSCs標(biāo)記物鑒定

免疫熒光法檢測顯示，與普通胃癌細胞相比，腫瘤球高表達干細胞標(biāo)記物CD44、CD54，但低表達胃壁細胞標(biāo)記物H+/K+-ATPase(圖3)。本課題組前期研究采用流式細胞術(shù)標(biāo)記CD44，亦證實分離自MKN45、SGC7901兩株人胃癌細胞的GCSCs CD44陽性率分別為92.5%±4.8%和82.1%±8.6%，分別顯著高于相應(yīng)普通胃癌細胞(67.9%±6.5%和53.0%±3.8%)。上述結(jié)果提示GCSCs富集的腫瘤球具有多向分化潛能。

三、胃癌細胞腫瘤球的遷移、侵襲能力

細胞劃痕實驗顯示，在低血清條件下，普通胃癌細胞遷移速度緩慢，24 h后劃痕與0 h時相比變化不明顯，腫瘤球24 h后劃痕愈合則較明顯(圖4A)，細胞遷移速度顯著大于普通胃癌細胞(圖4B)。細胞侵襲實驗顯示，于Transwell小室上室中加入細胞數(shù)量相同的懸液，24 h后腫瘤球穿膜細胞數(shù)顯著多于普通胃癌細胞(圖5A、5B)。上述結(jié)果表明GCSCs富集的腫瘤球與普通胃癌細胞相比具有更強的遷移、侵襲能力。

圖1 胃癌細胞不同代腫瘤球形成(×200)

A：腫瘤球克隆形成能力較普通胃癌細胞強(×40)；B：兩組克隆形成定量分析(*P<0.05)

圖3 胃癌細胞及其腫瘤球干細胞標(biāo)記物和胃壁細胞標(biāo)記物免疫熒光檢測(×200)

A：腫瘤球劃痕愈合速度較普通胃癌細胞快(×40)；B：兩組遷移速度定量分析(*P<0.01)

四、胃癌細胞腫瘤球的化療耐藥性

CCK-8實驗顯示，經(jīng)不同濃度順鉑干預(yù)24 h后，低濃度(0.01、0.1、1 μg/mL)順鉑處理組腫瘤球生長抑制率顯著低于普通胃癌細胞，而高濃度(10、100 μg/mL)順鉑處理組細胞大部分已死亡，腫瘤球與普通胃癌細胞間生長抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖6A)，細胞生存率曲線顯示順鉑對腫瘤球的50%抑制濃度(IC50)明顯高于普通胃癌細胞(圖6B)，表明GCSCs富集的腫瘤球與普通胃癌細胞相比更易對化療藥物產(chǎn)生耐藥。

A：腫瘤球侵襲能力較普通胃癌細胞強(×400)；B：兩組侵襲細胞定量分析(*P<0.01)

A：不同濃度順鉑干預(yù)24 h后腫瘤球和普通胃癌細胞生長抑制率比較(*P<0.01)；B：兩組細胞的生存率曲線

圖6SGC7901細胞及其腫瘤球?qū)樸K的耐藥性

討 論

自從Bonnet等[5]證明人類急性髓性白血病中存在CSCs以來，各種證據(jù)表明在腫瘤與機體的相互作用中，腫瘤最終的進展和轉(zhuǎn)移系由CSCs與局部微環(huán)境的相互作用所介導(dǎo)[6]。CSCs與組織干細胞有許多共同點，如自我更新、增殖、耐藥等，并主要負責(zé)維持腫瘤生長增殖[7]。開展CSCs相關(guān)研究的首要問題是分離、鑒定該類細胞，目前針對CSCs的分離方法主要有熒光激活細胞分選法(FACS)、側(cè)群細胞(SP細胞)亞群分選法和懸浮培養(yǎng)法。懸浮培養(yǎng)法早期用于干細胞的研究，近年已應(yīng)用該法在包括胃癌在內(nèi)的多種實體腫瘤中成功分離、鑒定出CSCs。本課題組前期研究[8]證實，基于克隆形態(tài)的分選策略可從人胃癌細胞株AGS中分離出GCSCs克隆。本實驗選用3株人胃癌細胞MKN45、MGC803、SGC7901，在含EGF、bFGF的無血清培養(yǎng)基中成功培養(yǎng)出懸浮的腫瘤球。該法操作簡單，且可動態(tài)觀察腫瘤球的變化。實驗結(jié)果顯示腫瘤球培養(yǎng)至第二、第三代后變得更為致密，數(shù)量增多，具有更強的自我更新能力(即在無血清培養(yǎng)條件下形成懸浮腫瘤球的能力)和增殖能力(即克隆形成能力)。

GCSCs目前仍缺乏高特異性的干細胞標(biāo)記物，其表面標(biāo)記物尚存在爭議。跨膜糖蛋白CD44是公認的前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤的CSCs標(biāo)記[9]，目前被用作GCSCs的標(biāo)記物亦較多見。CD54又名細胞間黏附分子-1(ICAM-1)，是一個相對分子質(zhì)量為90 kDa(1 Da=0.992 1 u)的免疫球蛋白超家族成員，廣泛表達于腫瘤細胞、基質(zhì)細胞和免疫細胞。Chen等[3]從胃腺癌患者的腫瘤組織和外周血中分離得到CD44+CD54+細胞群，該細胞群可形成腫瘤球，并具有自我更新和分化能力。因此，本實驗選用CD44和CD54作為標(biāo)記物鑒定腫瘤球中的GCSCs，同時選用胃壁細胞標(biāo)記物H+/K+-ATPase鑒定干細胞的多向分化能力，結(jié)果顯示與普通胃癌細胞相比，GCSCs富集的腫瘤球高表達CD44、CD54，低表達H+/K+-ATPase，表明其具有多向分化潛能。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是一種基本生理病理現(xiàn)象，參與了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。在EMT過程中，上皮細胞失去細胞黏附分子E-cadherin，獲得間質(zhì)標(biāo)記物如波形蛋白(VIM)以及遷移、侵襲能力[10-11]。胃癌患者骨髓組織中存在VIM mRNA表達上調(diào)并與腫瘤臨床分期、侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，且一些侵襲瘤內(nèi)血管的腫瘤細胞VIM蛋白呈強陽性染色，證實胃癌細胞存在EMT[12]。令人感興趣的是，近年研究[13]發(fā)現(xiàn)CSCs具有EMT特性，而經(jīng)歷EMT的腫瘤細胞亦呈現(xiàn)CSCs特性，表明EMT與CSCs之間有直接聯(lián)系。已有研究[4]發(fā)現(xiàn)分離自人胃癌細胞株SGC7901的GCSCs樣細胞具有高侵襲、轉(zhuǎn)移能力并呈現(xiàn)EMT表型，本研究亦通過細胞劃痕實驗和Transwell小室細胞侵襲實驗證實，與普通胃癌細胞相比，GCSCs富集的腫瘤球具有更強的遷移、侵襲能力。此種能力系通過何種途徑獲得、是否與EMT有關(guān)，均有待進一步研究。

胃癌患者對放化療易產(chǎn)生耐受，腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率高，預(yù)后較差，究其根源與常規(guī)治療對GCSCs 的靶向性不強有關(guān)，選擇性靶向GCSCs有望成為有效的胃癌治療手段[1]。本課題組前期研究[8]顯示GCSCs對5-氟尿嘧啶(5-Fu)的敏感性較低，表明GCSCs對化療藥物耐受可能是胃癌化療耐藥的重要機制之一。順鉑是臨床常用胃癌化療藥物，亦為胃癌體外藥敏試驗最常選用的經(jīng)典藥物之一，胃癌細胞對順鉑產(chǎn)生耐藥是含順鉑化療方案療效降低的主要原因[14]。本實驗結(jié)果顯示，順鉑對GCSCs富集的腫瘤球的IC50值明顯高于普通胃癌細胞，提示GCSCs較普通胃癌細胞更易對化療藥物產(chǎn)生耐藥，其耐藥機制有待進一步研究。

綜上所述，應(yīng)用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)法能成功獲得GCSCs富集的腫瘤球；腫瘤球高表達干細胞標(biāo)記物CD44、CD54，具有較強的自我更新、增殖、遷移、侵襲能力和多向分化潛能，對化療藥物更易產(chǎn)生耐藥性。基于上述特點，推測胃癌易發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移以及對常規(guī)化療藥物產(chǎn)生耐藥與GCSCs有關(guān)，靶向調(diào)節(jié)GCSCs的具體機制及其應(yīng)用于胃癌治療的可行性，尚待進一步研究。

1 Scopelliti A, Cammareri P, Catalano V, et al. Therapeutic implications of Cancer Initiating Cells[J]. Expert Opin Biol Ther, 2009, 9 (8): 1005-1016.

2 Takaishi S, Okumura T, Tu S, et al. Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44[J]. Stem Cells, 2009, 27 (5): 1006-1020.

3 Chen T, Yang K, Yu J, et al. Identification and expansion of cancer stem cells in tumor tissues and peripheral blood derived from gastric adenocarcinoma patients[J]. Cell Res, 2012, 22 (1): 248-258.

4 Yang L, Ping YF, Yu X, et al. Gastric cancer stem-like cells possess higher capability of invasion and metastasis in association with a mesenchymal transition phenotype[J]. Cancer Lett, 2011, 310 (1): 46-52.

5 Bonnet D, Dick JE. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell[J]. Nat Med, 1997, 3 (7): 730-737.

6 Vermeulen L, De Sousa E Melo F, van der Heijden M, et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment[J]. Nat Cell Biol, 2010, 12 (5): 468-476.

7 Vermeulen L, Sprick MR, Kemper K, et al. Cancer stem cells-old concepts, new insights[J]. Cell Death Differ, 2008, 15 (6): 947-958.

8 周志華，張建東，徐桂芳，等. 基于克隆形態(tài)分選胃癌干細胞及其對氟尿嘧啶敏感性的檢測[J]. 中華胃腸外科雜志, 2013, 16 (4): 376-380.

9 Patrawala L, Calhoun T, Schneider-Broussard R, et al. Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells[J]. Oncogene, 2006, 25 (12):1696-1708.

10 Yilmaz M, Christofori G. EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion[J]. Cancer Metastasis Rev, 2009, 28 (1-2): 15-33.

11 Thiery JP, Acloque H, Huang RY, et al. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease[J]. Cell, 2009, 139 (5): 871-890.

12 Iwatsuki M, Mimori K, Fukagawa T, et al. The clinical significance of vimentin-expressing gastric cancer cells in bone marrow[J]. Ann Surg Oncol, 2010, 17 (9): 2526-2533.

13 Mani SA, Guo W, Liao MJ, et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells[J]. Cell, 2008, 133 (4): 704-715.

14 Chun JH, Kim HK, Lee JS, et al. Weekly irinotecan in patients with metastatic gastric cancer failing cisplatin-based chemotherapy[J]. Jpn J Clin Oncol, 2004, 34 (1): 8-13.