史 健 楊洪濤 胡 銳 劉建紅 程小紅 陜西省中醫(yī)醫(yī)院腎病科 （西安 710003）

腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是所有慢性腎臟疾病進(jìn)行性發(fā)展的共同通路，是導(dǎo)致終末期腎衰竭的主要病理基礎(chǔ)。上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast，Myof）的轉(zhuǎn)分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是參與腎小管間質(zhì)纖維化的重要機(jī)制之一[1]。EMT受多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和激素的調(diào)節(jié)，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β1（TGF-β1）是最重要的促纖維化因子，主要通過(guò)Smads信號(hào)通路誘導(dǎo)其下游因子表達(dá)，啟動(dòng)并調(diào)節(jié)EMT的全過(guò)程[2]。在TGF-β1作用下，腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變及成纖維細(xì)胞活化增殖后均可表達(dá)α－SMA，α-SMA表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞是慢性腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎衰過(guò)程中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞，人腎組織研究中發(fā)現(xiàn)腎臟間質(zhì)內(nèi)α-SMA表達(dá)量與腎間質(zhì)纖維化的程度以及腎功能惡化程度呈正相關(guān)關(guān)系[3]。

我們?cè)谂R床上用腎復(fù)康Ⅱ號(hào)治療慢性腎衰竭，可以改善患者的臨床癥狀，防治腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展。本研究應(yīng)用腎復(fù)康Ⅱ號(hào)對(duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎（unilateral ureteral obstruction，UUO）誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化大鼠模型進(jìn)行干預(yù)性治療，觀(guān)察其抗腎臟組織纖維化的作用；觀(guān)察腎復(fù)康Ⅱ號(hào)含藥血清對(duì)TGF-β1所誘導(dǎo)的人腎小管上皮（HK-2）細(xì)胞平滑肌肌動(dòng)蛋白（a-SMA）表達(dá)的影響 ，初步探討腎復(fù)康Ⅱ號(hào)防治腎間質(zhì)纖維化的機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 藥物與試劑：腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊由山萸肉、菟絲子、金櫻子、仙靈脾、醋鱉甲、王不留行、姜黃、赤芍等12味中藥組成（由陜西中醫(yī)醫(yī)院提供，陜西省藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)院內(nèi)制劑，每粒0.3g），百令膠囊（杭州中美華東制藥），DMEM／F12培養(yǎng)基、Triton X-100（Gibco）；胎牛血清（HyClone）；BCA蛋白定量試劑盒、蛋白酶抑制劑、蛋白Marker、ECL化學(xué)發(fā)光底物（Pierce）；細(xì)胞裂解液、丙烯酰胺、Tris-Base、TEMED、十二烷基硫酸鈉、甘氨酸、麗春紅、硝酸纖維素膜（Amresco），鼠抗人a-SMA多克隆抗體（博士德生物），脫脂奶粉（完達(dá)山乳業(yè)）。10%水合氯醛、鹽水、碘伏、酒精、注射用青霉素鈉等。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞：選用清潔級(jí)雄性SD大鼠180只，體重200±20g，由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)進(jìn)（2007-007），適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分組，動(dòng)物室溫度22～25℃，濕度68～72%，顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水和自然晝夜節(jié)律光照。人腎小管上皮HK-2細(xì)胞由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院腎臟內(nèi)科孫世仁教授惠贈(zèng)。

1.2 儀 器 萊卡腎臟組織平推式切片機(jī)（LeiCASM2000R），萊卡冰凍切片機(jī)（LeiCACM1850），國(guó)產(chǎn)石蠟包埋機(jī)（雅博）、烤片機(jī)（LeiCAHI1220），日本奧林帕斯顯微鏡（OlympusBX 41），病理圖像分析軟件系統(tǒng)（HMIAS-2000），二氧化碳培養(yǎng)箱（CB150，德國(guó)賓德），超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司），酶標(biāo)儀（POLARstar OPTIMA，BMG Labtechnologies），倒置顯微鏡（尼康 E200），25cm2培養(yǎng)瓶，12，48，96孔板培養(yǎng)板（美國(guó)COSTAR公司），紫外分光光度計(jì)（UV1102，上海天美），離心機(jī)（L-530，賽特湘儀），電熱恒溫培養(yǎng)箱（GNP-9162，上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠(chǎng)），電泳槽（DYY-Ⅲ型）、電泳議（DYY-7C型）（北京六一），凝膠掃描成像系統(tǒng)（Gel DOC2000）。

1.3 方 法

1.3.1 腎復(fù)康Ⅱ號(hào)對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠模型的干預(yù)作用：大鼠適應(yīng)1周后采用輸尿管結(jié)扎方法[3]造模，術(shù)后常規(guī)肌肉注射青霉素3d。將90只大鼠隨機(jī)分成5組，平均每組18只。假手術(shù)組，模型組，小劑量組：腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊2.25g／kg·d，中劑量組：腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊4.5g／kg·d，大劑量組：腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊9g／kg·d。將腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊以溫開(kāi)水溶解后制成混懸液，于造模手術(shù)后1d開(kāi)始給予以上劑量組大鼠灌胃，灌胃容積為1mL／100g，假手術(shù)組及模型組給予同體積的蒸餾水灌胃。分別于灌胃后第7d、第14d、第21d各組處死6只大鼠，剖取右腎組織塊以10%福爾馬林-PBS溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光鏡200倍放大，光鏡下觀(guān)察腎間質(zhì)和腎小管的病變程度。以Masson染色光鏡下觀(guān)察不同時(shí)間段腎臟間質(zhì)纖維化的面積。

1.3.2 腎復(fù)康Ⅱ號(hào)含藥血清對(duì)TGF-β1所誘導(dǎo)的人腎小管上皮（HK-2）細(xì)胞平滑肌肌動(dòng)蛋白（a-SMA）表達(dá)的影響：含藥血清的制備：90只大鼠隨機(jī)分為3組。腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊、百令膠囊以溫開(kāi)水溶解后制成混懸液，腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊9g／kg·d，百令膠囊0.27g／kg·d給大鼠灌胃，空白組等體積的生理鹽水灌胃，灌胃容積為1mL／100g，連續(xù)7d。末次給藥后2h，水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，每組含藥血清混合，過(guò)濾除菌，并置于56℃水浴箱中滅活30min，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

細(xì)胞培養(yǎng)及分組：HK-2細(xì)胞置于含10%經(jīng)滅活胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞用0.25%胰酶消化成單細(xì)胞懸液，密度調(diào)至105細(xì)胞／mL，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)至約80%的融合狀態(tài)時(shí)改用無(wú)血清DMEM／F12培養(yǎng)基同步饑餓24h，使細(xì)胞進(jìn)入靜止期。24h饑餓同步后分為6組：①無(wú)血清對(duì)照組；②大鼠血清組（10%）；③TGF-β1（5ng／mL）組；④TGF-β1（5ng／mL）＋百令鼠血清組 （10%）；⑤TGF-β1（5ng／mL）＋大劑量含藥鼠血清組（10%）；⑥TGF-β1（5ng／mL）＋中劑量含藥鼠血清組（5%），各組均加入無(wú)血清DMEM／F12培養(yǎng)基5mL。細(xì)胞孵育48h后4℃PBS洗滌，裂解細(xì)胞，離心，蛋白定量，沸水加熱變性。

免疫印跡法檢測(cè)a-SMA的表達(dá)：GAPDH作為內(nèi)參，取40μg總蛋白與上樣液混合、變性，將蛋白加入電泳孔，電泳分離蛋白質(zhì)，電泳濃縮膠75V，分離膠120V，轉(zhuǎn)膜。分別加入一抗（1∶1000），4℃孵育過(guò)夜，二抗（1∶3000），暗室 X－膠片曝光，顯影、定影；凝膠成像系統(tǒng)照相并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，蛋白表達(dá)量用光密度表示。QuantityOne圖像分析軟件軟件分析目標(biāo)帶的光密度值，計(jì)算條帶的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 腎復(fù)康Ⅱ號(hào)對(duì)UUO大鼠腎組織形態(tài)學(xué)的影響 假手術(shù)組大鼠各時(shí)間點(diǎn)腎臟小管間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。UUO術(shù)后7d腎小管上皮細(xì)胞彌漫性空泡變性，灶狀腎小管擴(kuò)張，萎縮，偶見(jiàn)壞死。腎間質(zhì)水腫，較多淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，腎間質(zhì)增寬，少許間質(zhì)纖維化，腎小球病理改變不明顯。術(shù)后14d，腎小管結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，腎小管重度擴(kuò)張，上皮細(xì)胞壞死，腎間質(zhì)彌漫性巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和成纖維細(xì)胞增生，間質(zhì)彌漫綠染。術(shù)后21d，腎小管和間質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步破壞，出現(xiàn)彌漫的細(xì)胞增殖；治療組各期可見(jiàn)腎小管壞死及腎間質(zhì)纖維化，程度較UUO組輕。

對(duì)上述Masson染色病理切片采集圖像并進(jìn)行半定量分析，結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。

表1 造模不同時(shí)間段各組大鼠腎間質(zhì)纖維化面積（）（n＝6）

表1 造模不同時(shí)間段各組大鼠腎間質(zhì)纖維化面積（）（n＝6）

注：與模型組比較△P＜0.05

造模后組別7d 14d 21d假手術(shù)組 201.75±15.20△ 203.50±33.0△ 201.58±22.75△模型組 675.25±45.2810.20±96.75878.45±75.50小劑量組 475.28±56.20△ 515.40±89.75△ 550.15±75.58△中劑量組 358.96±33.60△ 400.25±57.88△ 437.45±69.81△大劑量組 348.23±43.62△ 389.25±47.63△ 407.75±80.75△

2.2 腎復(fù)康Ⅱ號(hào)含藥血清對(duì)TGF-β1所誘導(dǎo)的人腎小管上皮HK-2細(xì)胞a-SMA表達(dá)的影響 以GAPDH作為內(nèi)參，免疫印跡法檢測(cè)腎復(fù)康Ⅱ號(hào)含藥血清對(duì)TGF－β1所誘導(dǎo)的人腎小管上皮HK-2細(xì)胞a-SMA表達(dá)的影響，結(jié)果顯示腎復(fù)康Ⅱ號(hào)含藥血清和百令含藥血清組的a-SMA的表達(dá)量明顯降低，與TGF-β1組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果見(jiàn)表2，圖2。

表2 含藥血清對(duì)TGF-β1所誘導(dǎo)的人腎小管上皮HK-2細(xì)胞a-SMA表達(dá)的影響（n＝3）

3 討 論 UUO是應(yīng)用最廣泛的腎間質(zhì)纖維化的動(dòng)物模型，該模型腎間質(zhì)纖維化發(fā)生迅速[4]，我們選擇UUO模型作為軟堅(jiān)散結(jié)法研究腎間質(zhì)纖維化的模型。TGF-β1被公認(rèn)為是最重要的誘導(dǎo)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的核心因子，啟動(dòng)并調(diào)節(jié)EMT的全過(guò)程[5]，TGF-β1作用于腎小管上皮細(xì)胞，使其發(fā)生轉(zhuǎn)分化為 MyoFb，參與間質(zhì)纖維化的進(jìn)程。Smad蛋白是TGF-β家族的下游信號(hào)蛋白，TGF-β與其細(xì)胞膜表面受體結(jié)合后促使Smad蛋白磷酸化，磷酸化的Smad蛋白結(jié)合形成寡聚復(fù)合物進(jìn)入核內(nèi)，通過(guò)直接與DNA結(jié)合或與其它DNA結(jié)合蛋白結(jié)合等方式參與啟動(dòng)或抑制 轉(zhuǎn)錄因子而發(fā)揮作用，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、TEMT的發(fā)生和ECM的堆積。

圖1 Masson染色病理切片

圖2 TGF－β1所誘導(dǎo)的人腎小管上皮HK-2細(xì)胞a-SMA的表達(dá)

近年來(lái)中醫(yī)藥在治療腎間質(zhì)纖維化方面己顯示出較為明顯的優(yōu)勢(shì)，中藥多成分，多環(huán)節(jié)、多層次、多靶點(diǎn)的藥理學(xué)作用可能是其優(yōu)勢(shì)的重要特點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)大鼠腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管上皮細(xì)胞變形，脫落，細(xì)胞外基質(zhì)增加，纖維組織增生，腎間質(zhì)廣泛纖維化，體現(xiàn)了中醫(yī)痰、瘀固定不移、膠結(jié)難去的特點(diǎn)，結(jié)合大鼠的全身表現(xiàn)，模型符合中醫(yī)腎陽(yáng)虧虛，濁瘀兼有痰阻的證型特點(diǎn)。因此依據(jù)其基礎(chǔ)病機(jī)“腎氣虧虛，濁瘀內(nèi)阻”，制定益腎散結(jié)治療大法，組方腎復(fù)康Ⅱ號(hào)。其中以山萸肉、菟絲子、金櫻子、仙靈脾，溫補(bǔ)腎陽(yáng)，澀精固脫；以丹參、姜黃、赤芍活血化瘀，加用王不留行、鱉甲軟堅(jiān)散結(jié)，標(biāo)本兼顧，扶助正氣，祛除淤血積滯。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，丹參能降低TGF－β1表達(dá)，減少α-SMA表達(dá)，抑制成纖維細(xì)胞增殖、活化，促進(jìn)其凋亡，以及抑制ECM合成、促進(jìn)其降解[6]。我們以軟堅(jiān)散結(jié)法制定的腎復(fù)康Ⅱ號(hào)，在防治腎間質(zhì)纖維化發(fā)生，延緩腎臟病發(fā)展進(jìn)程取得較好的臨床療效。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，腎復(fù)康Ⅱ號(hào)可以減輕UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化及腎小管的損傷；腎復(fù)康Ⅱ號(hào)含藥血清明顯降低TGF-β1所誘導(dǎo)的人腎小管上皮HK-2細(xì)胞a-SMA的表達(dá)。由此推測(cè)，軟堅(jiān)散結(jié)法下調(diào)腎組織a-SMA的表達(dá)，抑制腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的合成，可能是其抑制纖維化的途徑之一。

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