武書哲 ，張 娜 ，田淑芬

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄研究中心，天津 300387；3.天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192）

無(wú)核葡萄以其食用方便、品質(zhì)優(yōu)良在市場(chǎng)上越來(lái)越受歡迎，因此選育優(yōu)質(zhì)、大粒、無(wú)核葡萄品種已成為葡萄育種的重要內(nèi)容之一。我國(guó)的無(wú)核葡萄育種多采用傳統(tǒng)的雜交方式，即利用有核品種作母本，無(wú)核品種作父本，但是其獲得無(wú)核后代的幾率較低，而且育種周期長(zhǎng)；三倍體雜交育種雖可以獲得無(wú)核葡萄，但是二倍體與四倍體的親和力差，獲得雜交后代難度同樣很大。1982年，美國(guó)葡萄育種學(xué)家Ramming等[1]首次報(bào)道了利用改良的White培養(yǎng)基進(jìn)行無(wú)核葡萄胚的胚珠內(nèi)培養(yǎng)，并獲得了兩株實(shí)生苗。自此以后，利用胚挽救技術(shù)，將無(wú)核葡萄品種做母本，在合子胚敗育之前將其取出并在適宜的條件下離體培養(yǎng)，使其繼續(xù)發(fā)育成苗，最終形成完整植株，不僅極大地提高后代的無(wú)核率，也加快了無(wú)核葡萄的育種速度。

本試驗(yàn)以希姆勞特（歐美雜交種，從日本引入，美國(guó)育種，該品種豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗性強(qiáng)、適應(yīng)性廣，在無(wú)核葡萄中，屬大粒大穗型品種）為母本，與玫瑰香優(yōu)系（天津市農(nóng)科院葡萄研究中心從表面上玫瑰香葡萄篩選，較普通玫瑰香品種香氣濃郁，果穗松緊度適中，果粒均勻），雜交進(jìn)行玫瑰香型無(wú)核大粒的新品種繁育，研究胚挽救過(guò)程中培養(yǎng)基及添加物不同濃度對(duì)胚發(fā)育的影響，旨在確定適宜無(wú)核葡萄希姆勞特的胚挽救幼胚離體培養(yǎng)體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及胚挽救的基本方法

本試驗(yàn)于2013～2014年在天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄研究中心和天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。雜交材料為希姆勞特×玫瑰香。

在初花期采集父本的花粉，花前3～4d母本去雄，柱頭上開始分泌粘液時(shí)授粉，以24h為間隔連續(xù)授粉3次。

在葡萄開花授粉后25d起每隔7d對(duì)希姆勞特×玫瑰香胚珠的發(fā)育及敗育勢(shì)態(tài)進(jìn)行了定期觀察。隨機(jī)取20粒果實(shí)，稱其漿果單粒重，然后剝開果實(shí)，取出胚珠，稱取胚珠的平均重量，統(tǒng)計(jì)其胚珠平均發(fā)育程度及不同時(shí)期漿果內(nèi)的胚珠數(shù)。

胚挽救的程序參照王愛(ài)玲[2]的方法進(jìn)行，從剖開的胚珠中選取長(zhǎng)度大于2mm的胚珠接種在發(fā)育培養(yǎng)基上進(jìn)行胚珠內(nèi)胚培養(yǎng)。每個(gè)三角瓶（150mL）內(nèi)接種15個(gè)胚珠，培養(yǎng)60d后無(wú)菌條件下剖開胚珠，在胚珠喙端發(fā)現(xiàn)的白色胚即為發(fā)育胚。統(tǒng)計(jì)接種胚珠數(shù)、胚發(fā)育數(shù)、胚發(fā)育率。胚發(fā)育率=胚發(fā)育數(shù)/接種胚珠數(shù)×100%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同基本培養(yǎng)基試驗(yàn)

取希姆勞特×玫瑰香授粉后32d的雜交胚珠接種在ER/Nitsch+GA30.5mg/L+IAA1.5mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖60g/L+活性炭1g/L+瓊脂5g/L這兩種培養(yǎng)基中，篩選適宜的基本培養(yǎng)基。

1.2.2 培養(yǎng)基中添加不同濃度6-BA的離體培養(yǎng)試驗(yàn)

取希姆勞特×玫瑰香授粉后32d的雜交胚珠接種在 Nitsch+GA30.5mg/L+IAA1.5mg/L+蔗糖60g/L+活性炭1g/L+瓊脂5g/L培養(yǎng)基中，其中分別添加不同濃度（0.2、0.5、0.8mg/L）的 6-BA，研究不同濃度的6-BA對(duì)胚發(fā)育的影響。

1.2.3 培養(yǎng)基中添加不同濃度活性炭的離體培養(yǎng)試驗(yàn)

取希姆勞特×玫瑰香授粉后32d的雜交胚珠接種在 Nitsch+GA30.5mg/L+IAA1.5mg/L+蔗糖60g/L+6-BA0.5mg/L+瓊脂5g/L培養(yǎng)基中，其中分別添加不同濃度（1、1.5、3g/L）的活性炭，研究不同濃度的活性炭對(duì)胚發(fā)育的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 希姆勞特果實(shí)、胚珠重及胚珠數(shù)的變化

通過(guò)定期觀察胚珠的發(fā)育動(dòng)態(tài)，可以看出母本果實(shí)重量一直呈增加趨勢(shì)，胚珠重呈先增加后下降趨勢(shì)，在授粉后32d胚珠重達(dá)到最大。由此可知，希姆勞特胚敗育時(shí)期在授粉后32d。單粒漿果內(nèi)發(fā)育胚珠的平均數(shù)隨漿果的逐漸增大而減少，也說(shuō)明了胚珠的敗育逐漸增強(qiáng)（表1）。

表1 不同時(shí)期希姆勞特果實(shí)、胚珠重及胚珠數(shù)

2.2 不同基本培養(yǎng)基對(duì)葡萄離體幼胚發(fā)育的影響

通過(guò)不同基本培養(yǎng)基離體培養(yǎng)胚珠試驗(yàn)，可以看出希姆勞特×玫瑰香的雜交胚珠在Nitsch培養(yǎng)基中胚發(fā)育率明顯高于ER，所以希姆勞特幼胚較適宜在Nitsch培養(yǎng)基中培養(yǎng)（表2）。

表2 不同基本培養(yǎng)基對(duì)胚發(fā)育的影響重及胚珠數(shù)

2.3 不同濃度6-BA對(duì)葡萄離體幼胚發(fā)育的影響

通過(guò)培養(yǎng)基中添加不同濃度6-BA的離體培養(yǎng)試驗(yàn)，可以看出0.5mg/L 6-BA的胚發(fā)育率最高，為13.33%，其次是0.8mg/L 6-BA，胚發(fā)育率為10.67%，而0.2mg/L 6-BA的胚發(fā)育率最低，為9.33%（表3）。

表3 不同濃度6-BA對(duì)胚發(fā)育的影響

2.4 不同濃度活性炭對(duì)葡萄離體幼胚發(fā)育的影響

通過(guò)培養(yǎng)基中添加不同濃度活性炭的離體培養(yǎng)試驗(yàn)，可以看出1g/L活性炭的胚發(fā)育率最高，為13.33%，其次是1.5g/L活性炭的胚發(fā)育率為5.33%，而3g/L活性炭的胚發(fā)育率最低，為5.17%（表4）。

表4 不同濃度活性炭對(duì)胚發(fā)育的影響

3 討論

胚挽救技術(shù)雖然使無(wú)核葡萄生物育種成為可能，但是它目前仍然存在很多問(wèn)題，成苗率低，技術(shù)要求高，胚挽救苗較弱等，如何提高胚挽救過(guò)程中胚發(fā)育率，是提高無(wú)核育種技術(shù)效率的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。

培養(yǎng)基在胚珠離體培養(yǎng)條件下可以提供幼胚繼續(xù)發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和激素，是影響胚挽救是否成功的重要因素之一[1]。郝燕、田莉莉[3-4]經(jīng)過(guò)試驗(yàn)研究認(rèn)為，在胚珠培養(yǎng)階段使用ER固-液雙相培養(yǎng)基胚發(fā)育較好。而唐冬梅[5]則認(rèn)為，MM3作為胚發(fā)育培養(yǎng)基效果最好。蔣愛(ài)麗等則育成了胚培的新品種[6]。

未成熟葡萄幼果中含有較多的酚類物質(zhì)，使得在胚挽救中發(fā)生嚴(yán)重褐變，從而降低胚挽救成苗率?；钚蕴坑兄诮档团咧楹只膸茁蔥7-8]。雖然活性炭有吸附作用，可以吸收有害物質(zhì)，但也可能吸收培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此要適量添加，一般為0.1%～0.3%。Nookaraju[9]發(fā)現(xiàn)在圓錐花序上噴涂吡效?。–PPU）并且在胚珠培養(yǎng)基中添加丙烯酸丙酯（BA）可以提高胚珠敗育型葡萄的胚挽救效率。

本研究確定了適宜無(wú)核葡萄希姆勞特的胚挽救幼胚離體培養(yǎng)體系：無(wú)核葡萄希姆勞特品種適宜用含 GA30.5mg/L、蔗糖 60g/L、瓊脂 5g/L、pH值5.8的Nitsch培養(yǎng)基作胚珠發(fā)育培養(yǎng)基，添加0.5mg/L 6-BA、1.0mg/L活性炭，胚發(fā)育率最高，達(dá)到13.33%。此結(jié)果為進(jìn)一步研究利用無(wú)核葡萄希姆勞特胚挽救選育玫瑰香型大粒無(wú)核葡萄技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

［1］Ramming D-W，Emershad R L.In-ovule embryo culture of seeded and seedlessVitis vinifera（Abst）［J］.Hortseience，1982，17（3）：487.

［2］王愛(ài)玲，王躍進(jìn)，唐冬梅，等.提高無(wú)核葡萄胚挽救中幼胚成苗率的研究［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（20）：4238-4245.

［3］郝燕，楊瑞，王鴻，等.無(wú)核葡萄剝胚胚挽救技術(shù)關(guān)鍵影響因子［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，（9）.

［4］田莉莉.抗病無(wú)核葡萄胚挽救育種及種質(zhì)創(chuàng)新［D］.陜西安：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2007.

［5］唐冬梅，王躍進(jìn)，趙榮華，等.我國(guó)研究出無(wú)核葡萄育種新技術(shù)［J］.吉林農(nóng)業(yè)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)信息，2005，（8）：47.

［6］蔣愛(ài)麗，李世誠(chéng)，金佩芳，等.胚培無(wú)核葡萄新品種—滬培 1號(hào)［J］.果樹學(xué)報(bào)，2007，24（3）：402-403.

［7］郭印山.葡萄胚敗育機(jī)理與胚挽救技術(shù)研究［D］.沈陽(yáng)：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

［8］田莉莉.抗病無(wú)核葡萄胚挽救育種及種質(zhì)創(chuàng)新［D］.西安：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2007.

［9］ANookaraju，M S Barreto，G S Karibasappa，et al.Synergistic effect of CPPU and benzyladenine on embryo rescue in six stenospermocarpic cultivars of grapevine［J］.Vitis，2007，46（4）：188-191.