張海江，王向紅，毛宇豪，孫 佳

(淮陰工學(xué)院 生命科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003)

0 引言

食品在加工、運輸、儲藏和銷售過程中，會由于微生物污染導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)而造成重大經(jīng)濟損失。加入食品防腐劑是一種簡單有效避免食品腐敗的方法[1]。食品防腐劑包括化學(xué)防腐劑、天然防腐劑和復(fù)合防腐劑，目前應(yīng)用以化學(xué)防腐劑為主。由于化學(xué)防腐劑有一定的毒副作用，對人體健康存在潛在的危害，近年來，隨著人們對食品安全要求的提高，天然防腐劑因其高效、安全的特點越來越受到世界各國的重視[2]。我國的天然防腐劑應(yīng)用有著幾千年的悠久歷史，主要以傳統(tǒng)中藥為基礎(chǔ)，不僅能夠防腐，還可賦予食品獨特的風(fēng)味[3]。本文將系統(tǒng)研究肉桂、丁香、牛至等天然香辛料及其主要成分單體對常見食源性致病菌和腐敗菌的體外抑制活性，并考察食物酸堿環(huán)境對抑菌活性的影響，為進(jìn)一步開發(fā)高效安全的天然防腐劑打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

藥品：肉桂醛(含量>98%)購自湖北遠(yuǎn)程共創(chuàng)科技有限公司；肉桂油、丁香油、牛至油、丁香酚(含量>90%)、百里香酚(含量>98%)均購自江西吉安華美植物油提煉廠。經(jīng)實驗室GC-MS和HPLC分析后，各藥品均質(zhì)量合格。除百里香酚精密配制為10%的DMSO溶液外，其余藥品均直接用于抑菌試驗。

試劑：DMSO、KH2PO4、Na2HPO4均為分析純，超純水由實驗室Millipore純水機自制。

1.2 菌種

致病菌：大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、沙門氏菌(Salmonella)、志賀菌(Shigella)

真菌：釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae Hansen)

桿菌：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)

以上菌株均由淮安市商品檢驗檢疫局檢疫中心提供。

1.3 培養(yǎng)基

孟加拉紅培養(yǎng)基用于酵母菌的活化和計數(shù)；胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)用于上述致病菌和枯草芽孢桿菌的活化和計數(shù)；胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)用于上述致病菌和枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)；麥芽浸粉肉湯(MEB)用于酵母菌的培養(yǎng)。以上培養(yǎng)基均購于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.4 儀器與設(shè)備

移液槍(雷勃，美國賽默飛世爾科技公司)、恒溫?fù)u床(江蘇太倉市實驗設(shè)備廠)、超聲波洗滌器(昆山市超聲儀器有限公司)、生物顯微鏡(上海長方光電儀器廠)、pH計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)、pH復(fù)合電極(上海盛磁儀器有限公司)、立式壓力蒸汽滅菌器(上海三申醫(yī)療器械有限公司)、生物潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(太倉精密儀器設(shè)備有限公司)

1.5 方法

1.5.1菌種的活化

無菌室中將供試菌株移接入相對應(yīng)的試管斜面培養(yǎng)基上，致病菌和桿菌均置37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，釀酒酵母菌置28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，以活化菌種[4]。0～4℃冷藏，留作備用。

1.5.2菌懸液的制備

取少量經(jīng)活化的待測菌種，置于裝有10 mL 的無菌水試管中，振蕩均勻，制成菌懸液。用無菌吸管取1.0 mL 充分混合的菌懸液加入裝有9.0 mL 無菌水的試管中，依次進(jìn)行稀釋，最后制成濃度為106～108個/mL的菌懸液，采用顯微鏡直接計數(shù)[5]。

1.5.3培養(yǎng)基制備

分別準(zhǔn)確配制0.2 mol/L Na2HPO4溶液和KH2PO4溶液，按體積比Na2HPO4：KH2PO4=12.3：87.7混合均勻，得pH=6的緩沖溶液[6]。分別以6 mol/L HCl溶液和0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH值，得到pH=5和pH=7的緩沖溶液。分別溶解配制不同pH值的培養(yǎng)基溶液，并以6 mol/L HCl溶液和0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)各培養(yǎng)基溶液的pH值，并用pH計標(biāo)定，分別制得pH=5、pH=6和pH=7的培養(yǎng)基溶液。

1.5.4抑菌活性測定

1.5.4.1 濾紙片法

將高壓蒸汽滅菌過的培養(yǎng)基冷卻至50℃左右，移取50 μL菌懸液于上述培養(yǎng)基中，搖晃混合均勻后傾倒在相應(yīng)的培養(yǎng)皿中，制成含菌平板。將厚度1.5 mm的濾紙用打孔機制成直徑為6 mm的小圓紙片，滅菌后分別浸于藥液和溶劑中2小時。瀝干后貼在含菌平板上，每個培養(yǎng)皿中等距放置4片含藥濾紙片，倒置培養(yǎng)一定時間后，測定抑菌圈直徑。各菌株的培養(yǎng)溫度和時間分別為：致病菌和桿菌為37℃、24 h；釀酒酵母菌為28℃、48 h。各試驗平行測定三次[7]。

1.5.4.2 溶液二倍稀釋法

(1)樣品溶液配制：取無菌試管排成一排。除第1管內(nèi)加入10 mL培養(yǎng)基溶液外，其余每管加入培養(yǎng)基溶液5 mL。準(zhǔn)確移取20 μL各供試精油和20 μL DMSO(助溶)加入至第1管中，超聲溶解均勻，得2 μL/mL的藥品溶液。從第一管中吸取5 mL含藥培養(yǎng)基溶液至第2管，超聲混勻后再吸取5 mL至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋得到0.008～2 μL/mL的系列溶液[8]。

(2)陰性對照溶液的制備：試管中加入5 mL培養(yǎng)基，不加供試品。

(3)陽性對照溶液的制備：試管中加入5 mL培養(yǎng)基，按上述樣品溶液配制方法中的第1管加藥濃度加入供試品。

各試管塞好塞子，置蒸汽滅菌鍋中121℃滅菌20 min。取出冷卻后，分別向各管中加入受試菌懸液20 μL，每管最終受試菌的濃度約為105～106個/mL，陽性對照溶液中不加菌。將接種好的試管置搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速160 r/min。各類菌的培養(yǎng)溫度、時間分別為：致病菌和桿菌37℃、24 h；釀酒酵母菌28℃、48 h。取出后，肉眼觀察各管的菌株生長情況[9]。陽性對照管溶液澄清透明表明滅菌完全，且培養(yǎng)過程中無污染，陰性對照管溶液渾濁表明各菌株生長良好。以澄清透明的供試藥品中最低濃度者為受試菌的MIC。各實驗均平行測定三次。

1.5.4.3 pH值對抑菌效果的影響

大多數(shù)食品的酸堿環(huán)境為弱酸性和中性，即pH值5～7范圍。因此，本文按1.5.4.2二倍稀釋法，分別測定不同pH(5、6、7)條件下各藥品對各供試菌種的MIC值，考察pH值對各藥品體外抑菌活性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 濾紙片法

各藥品的抑菌圈直徑見表1。

表1 幾種香辛料精油及單體的抑菌直徑(n=3)

抑菌圈判斷標(biāo)準(zhǔn)為：直徑大于1.5 cm為最敏感型，1.0～1.5 cm為中度敏感型，0.7～0.9 cm為低度敏感型，直徑小于0.7 cm為不敏感型[10]。由表1可知，各樣品對于常見的致病菌、桿菌、酵母菌均有良好的抑菌效果。其中，肉桂醛和肉桂油的抑菌效果最為明顯，除肉桂醛對大腸桿菌為中度敏感外，肉桂醛和肉桂油對其余的供試菌種的抑菌活性都屬于最敏感型；丁香油和丁香酚對沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌的抑菌活性為中度敏感型，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀菌的抑菌活性為最敏感型；牛至油和10%百里香酚對各供試菌種均顯示出中度敏感。

2.2 不同pH值下的二倍稀釋法測定結(jié)果

各香辛料精油及單體的最低抑菌濃度MIC見表2。

各香辛料精油及單體對各受試菌種均顯示出良好的體外抑制活性，三次平行試驗所得MIC值一致。肉桂醛、丁香酚、百里香酚分別是肉桂油、丁香油和牛至油中的主要成分[11-13]。由表2可見，肉桂油與肉桂醛的MIC相近，二者表現(xiàn)出相似的抑菌活性，說明肉桂醛為肉桂油中的主要抑菌成分，且肉桂油中存在其它抑菌活性物質(zhì)或其它成分與肉桂醛存在協(xié)同增效的作用。同樣的情況亦見于丁香油和丁香酚。而百里香酚的MIC均明顯小于牛至油，表明百里香酚的抑菌活性好于牛至油。在弱酸至中性條件下，肉桂、丁香精油及其單體的MIC值減小，尤其對枯草芽孢桿菌的抑菌活性明顯增強，表明酸度增大對于抑菌是有利的。牛至油及其單體百里香酚的MIC不隨pH波動而改變，表明其體外抑菌活性與酸堿度無關(guān)。

表2 各香辛料精油及單體的MIC(n=3)

續(xù)表2 各香辛料精油及單體的MIC(n=3)

3 結(jié)論

研究肉桂、丁香和牛至精油及其單體對常見的食品致病菌和腐敗菌的體外抑菌作用，結(jié)果表明各精油及單體對各菌種均具有良好的體外抑菌活性，其中對枯草芽孢桿菌的抑菌效果最強。肉桂醛和肉桂油對各供試菌種的MIC值為0.04～0.50 μL/mL；丁香油和丁香酚的MIC值為0.06～1.50μL/mL；牛至油和百里香酚的MIC值為0.06～1.00 μL/mL。在pH5～7的弱酸至中性條件下，隨著酸度增大，肉桂油、丁香油及其單體成分的體外抑菌活性有所增強。

肉桂、丁香、牛至是常見的天然香辛料，應(yīng)用歷史悠久，安全性好。本文研究表明這些香辛料精油及其單體具有良好的天然防腐劑開發(fā)價值。

感謝淮安市商品檢驗檢疫局檢疫中心為本項目提供受試菌株。

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