王碩 韓雪琳 高歡 宗浩 韓黎

(1.四川師范大學生命科學學院，成都 610101;2.中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院疾病預防控制所醫(yī)院感染監(jiān)控中心，北京 100071)

磷脂酶D(Phospholipase D，PLD)即磷脂酰膽堿磷脂水解酶 (EC3.1.4.4)，普遍存在于細菌、真菌以及哺乳動物中。PLD是細胞內的重要信號效應蛋白，其活性變化可以調節(jié)多種細胞膜受體及胞內信號蛋白以發(fā)揮重要生理功能，如肌動蛋白的骨架重排，細胞分裂、分泌，免疫及炎癥反應等［1］。因此，PLD已漸漸成為臨床藥物研發(fā)的重要治療靶點之一。

煙曲霉 (Aspergillus fumigatus)是一種廣泛存在并通過空氣傳播的腐生條件致病真菌。其分生孢子可以通過呼吸道進入人體引起肺部感染，引起炎癥因子釋放、呼吸暴發(fā)等天然免疫反應，進而引發(fā)侵襲性曲霉病。研究發(fā)現(xiàn)，煙曲霉孢子在被吸入肺泡后可誘發(fā)A549肺II型上皮細胞肌動蛋白骨架重排從而內化侵入細胞，并顯著激活PLD［2］。目前這些反應的具體調控機制仍不清楚。

為了解析肺上皮細胞應對煙曲霉感染的天然免疫機制，對PLD信號調控機制的研究具有重要意義。眾所周知，PLD可水解細胞膜磷脂生成磷脂酸(phosphotidic acid，PA)和膽堿，而PLD介導的PA生成被認為是真核細胞內重要的信號轉導途徑［3］。因此，我們優(yōu)化了一種測定細胞內PLD活性的方法［4-5］:通過測定PA的含量間接反應PLD活性。PA在脂蛋白脂肪酶的作用下，生成3-磷酸甘油 (G3P);3-磷酸甘油在3-磷酸甘油氧化酶(GPO)作用下，生成H2O2和磷酸二羥基丙酮;H2O2在Amplex Red的作用下生成Resorufin(一種熒光物質);最后通過熒光酶標儀測定熒光強度，通過熒光強度高低反應PA含量多少，間接反應了PLD的活性。本研究以A549肺II型上皮細胞為實驗對象，建立了適合肺上皮細胞磷脂酶D活性測定的方法，為進一步探討煙曲霉內化侵入肺上皮細胞過程中PLD的基本規(guī)律及主要信號通路奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 菌株和細胞系

煙曲霉菌株為ATCC13073，生長培養(yǎng)基為沙堡弱 (SDA)瓊脂培養(yǎng)基。37℃下生長3～4 d后，用含0.01%吐溫80的磷酸鹽緩沖液 (PBST)收獲孢子，無菌脫脂紗布過濾去除菌絲，4℃保存。細胞為人肺腺癌細胞系A549，于DMEM完全培養(yǎng)基 (含 100 μg/mL的鏈霉素、100 μg/mL的青霉素和10%胎牛血清)中，置于37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

胎牛血清 (四季青公司)，DMEM(Giobco公司)。脂蛋白脂肪酶 (lipoprotein lipase)、3-磷酸甘油氧化酶 (L-Glycerol-3-phosphate oxidase，GPO)、Amplex Red Reagent(10-acetyl-3，7-dihydrophenoxazine)、辣根過氧化物酶 (Peroxidase)、PA標準品 (PA standard)、佛波醇 (PMA)均購自Sigma公司。終止劑 (Amplex Red Stop Reagent，Invitrogen公司)。

1.3 膨脹孢子制備

煙曲霉休眠孢子以1×108/mL置于SDA液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)箱中搖培4 h得到膨脹孢子。分別將膨脹孢子及休眠孢子轉移至滅菌的15 mL離心管中，3 000 r/min離心10 min，棄上清，加入5 mL PBST渦旋振蕩，于3 000 r/min離心6 min洗孢子兩次，放入4℃冰箱備用(24 h內使用)。

1.4 實驗方法

細胞內脂質的提取 細胞內脂質提取采用Bligh和 Dyer甲醇/氯仿法［6］，并加以改良。A549細胞以1×106/皿接種于35 mm皿中，12 h后將培養(yǎng)液換成不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗細胞一次，根據不同分組處理細胞;處理結束后吸出反應液，加入500 μL甲醇 (-20℃預冷);將培養(yǎng)皿置于冰板上，刮取細胞于離心管中，加入250 μL 1 mol/L NaCl和 500 μL 氯仿 (-20℃預冷);劇烈震蕩2 min;3 400 r/min，4℃條件下離心10 min，取下層有機相450 μL，氮吹儀吹干。樣品可保存于-20℃ (12 h內測定)。

PA含量的測定 用20 μL 1%TirtonX-100水溶液溶解樣品;充分溶解后加入80 μL Reagent 1(包含 10 000 units/mL lipase，50 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl(pH7.4)，37℃恒溫水浴孵育1 h;96℃恒溫金屬浴3 min使磷脂酶熱失活，變性的酶通過離心 (7 200 g，4℃，5 min)除去;取 50 μL 上清于黑色不透光96孔板中 (costar)，加入50 μL Reagent 2［包含5 units/mL GPO，5 units/mL peroxidase，300 μmol/L Amplex Red Reagent，0.2%Triton X-100，40 mmol/L NaCl，40 mmol/L Tris-HCl(pH7.4)］，室溫孵育 30 min;加入 20 μL Amplex Red Stop Reagent室溫孵育30 min;最后用熒光酶標儀 (SpectraMax M5，Molecular Devices)測量其熒光強度(激發(fā)光為544 nm，發(fā)射光為590 nm)。

實驗分組 陰性對照為無孢子刺激組;陽性對照為50 ng/mL PMA刺激30 min組;血清調理孢子用含10%人血清的PBST，37℃下共孵育30 min，以感染復數 (multiplicity of infection，MOI)=10的比例，刺激細胞30 min;空白對照組無細胞，無刺激，只加反應試劑。

1.5 統(tǒng)計學處理

數據以測定數值減去空白對照組熒光強度為實際熒光強度值，采用GraphPad Prism 5.01和Excel進行統(tǒng)計檢驗分析，P＜0.05為差異有顯著性意義。本文所有結果均為3次重復的平均值。

2 結 果

2.1 PA標準曲線的建立

PA標準品用1%TirtonX-100水溶液溶解稀釋至不同濃度 (5、10、20、30、40、50、60、80、100、150、200、250 μmol/L)。取20 μL 進行 PA 含量測定，每一個點代表三次重復測量結果 (Mean±SD)。結果如圖1所示。PA標準品在5～250 μmol/L呈線性關系 (R2=0.990)，在 5 ～60 μmol/L 線性擬合度略低 (R2=0.988)。

2.2 煙曲霉刺激A549細胞后PLD活性顯著升高

用人血清調理煙曲霉膨脹孢子 (SC)刺激A549細胞30 min，對細胞內提取的脂質進行梯度稀釋后測定PA含量。PA含量隨稀釋濃度的下降而下降(見圖2)，說明該方法較為穩(wěn)定。PMA是PLD的激活劑，可誘導PA含量升高。煙曲霉膨脹孢子刺激細胞30 min后PA含量上升，顯著高于對照組和PMA刺激組 (見圖3)，間接反應PLD活性增強。說明煙曲霉膨脹孢子內化侵入肺上皮細胞后可顯著激活細胞內PLD活性。

2.3 煙曲霉萌發(fā)對細胞內PLD活性的影響

人血清調理煙曲霉休眠孢子 (RC)和人血清調理膨脹孢子 (SC)分別刺激A549細胞30 min，結果見圖4。休眠孢子刺激30 min后細胞內PA含量無明顯變化，膨脹孢子刺激30 min后則顯著升高。說明，煙曲霉孢子可顯著激活細胞內PLD活性。

圖1 PA標準曲線:a.5～250 μmol/LPA標準曲線，b.5～60 μmol/LPA標準曲線 圖2 細胞內脂質提取物梯度稀釋后PA含量變化 圖3煙曲霉刺激對PLD活性的影響 圖4 煙曲霉不同形態(tài)刺激對細胞內PLD活性的影響Fig.1 Standard curves of PA measurement up to 250 μmol/L(a)and 60 μmol/L(b)Fig.2 A test of the credibility of the PA levels measuring method used in the experiment:a curve of measured values for each diluted sample PA levels against the its diluted multiple Fig.3 A549 cells showed levels of PLD activity after incubated with the A.fumigatus Fig.4 The different morphology of A.fumigatus affects the PLD activity of A549 cells

3 討 論

PLD是細胞內重要的跨膜信號轉導酶，參與調節(jié)抗體受體及補體受體介導的多種細胞信號通路，其活性同肌動蛋白骨架改變緊密相聯(lián)，并與炎癥因子的釋放密切相關。PLD活性影響多種細胞信號途徑，如細胞生長、增殖、分化、遷移、胞吞與胞吐現(xiàn)象以及細胞骨架重組等。病原性真菌感染、炎癥、癌癥以及神經系統(tǒng)退變性等疾病常會引起PLD活性異常。PLD激活在病原體侵染宿主細胞過程中扮演著重要的角色，如巨噬細胞中PLD與吞噬作用密切相關，病原體刺激后PLD活性可上升10倍以上［7］;單核增生李斯特菌內化侵入相應的宿主細胞后可誘導細胞骨架發(fā)生重排并激活細胞內PLD活性［8］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)上皮細胞在應對煙曲霉侵染過程中伴隨著PLD激活，但PLD激活與病原體侵襲宿主細胞功能的關系尚不清楚。因此，PLD活性變化的測定尤為重要。目前測定PLD活性方法主要有PLD活性測定試劑盒［9］、底物放射標記法［10］以及熒光高效液相法［11］等。其中，常用的PLD活性檢測方法是底物放射標記物法:以放射標記的磷脂酰膽堿為底物，PLD催化水解其末端的磷酸二酯鍵生成第二信使分子磷脂酸和親水性的膽堿;膽堿經膽堿氧化酶作用后，用液體閃爍記數儀測定反應中釋放出的［3H］膽堿;根據實驗中所使用的底物濃度和酶蛋白含量將實驗結果轉變?yōu)槟憠A的釋放量，從而反應PLD的活性。然而上述測定方法分別存在敏感性不高、有放射性污染和操作復雜的缺點，且對于上皮細胞中PLD活性測定并不理想。其中底物放射標記法雖然靈敏且結果準確，但是存在放射性污染，對實驗室及操作人員有較高的要求，在普通實驗室難以開展。我們利用PLD活性測定試劑盒開展上述實驗。結果發(fā)現(xiàn)，試劑盒法在檢測肺上皮細胞PLD活性變化中應用效果不佳，結果不穩(wěn)定。

鑒于此，我們通過優(yōu)化建立細胞內PA含量測定方法來間接反應PLD活性。細胞受到外源刺激后，使得 PLD活化而引起胞內 PA含量上升［12］。Amplex Red Reagent是對H2O2敏感的探針。PA在一系列酶的作用下生成H2O2;H2O2在辣根過氧化物酶存在的條件下，和Amplex Red reagent 1∶1結合產生高度熒光物質resorufin;resorufin在571和585 nm處有最大吸光度值，且在多數生物樣本中熒光干擾較小。因此可以通過熒光強度的高低來反應PLD活性。我們利用該方法建立了PA標準曲線。發(fā)現(xiàn)PA標準品在5～250 μmol/L呈線性關系，在低濃度時這種線性擬合度略低。隨后，我們檢測了肺上皮細胞PLD活性變化。研究發(fā)現(xiàn)，該方法可以敏感而穩(wěn)定的反應出PLD活性變化。煙曲霉刺激A549細胞后，PLD活性明顯升高;膨脹孢子在這一過程中的激活能力顯著高于休眠孢子。研究結果與本研究組之前用底物放射標記法測定結果一致［2］。

綜上所述，本研究通過檢測細胞內PA含量間接反應上皮細胞中PLD活性變化情況。通過對煙曲霉刺激細胞內PLD活性變化分析，認為該方法靈敏、結果準確、快速及穩(wěn)定，是測定上皮細胞PLD活性變化的理想方法，為進一步研究煙曲霉內化侵入上皮細胞的機制奠定了基礎。

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