袁 兵 湯 琦 張云輝 許建彪 廖 鳳 譚 燕 黃云超

(昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院，云南 昆明 650118)

目前肺癌的死亡率居各種惡性腫瘤之首〔1〕，由于大多數(shù)患者診斷時腫瘤出現(xiàn)遠處轉移，血管生成是實體腫瘤生長和侵襲轉移的必要條件，研究肺癌血管生成對肺癌的防治尤為重要。而結腸癌轉移相關基因(MACC1)是新近發(fā)現(xiàn)的一個與結腸癌轉移密切相關的基因，MACC1基因的表達改變不僅在腸癌，而且可能包括肺癌在內的多種腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉移相關〔2～6〕，MACC1作為肝細胞生長因子(HGF) /c-met信號通路中的重要調節(jié)因子，能夠上調c-met的表達〔2〕，既往研究顯示c-met能夠調節(jié)MAPK、STAT和PI3k-Akt等多條下游信號通路，這些通路是細胞核內主要調節(jié)通道，與腫瘤細胞增殖、運動、浸潤、轉移及血管生成等有關，說明MACC1可能在肺癌腫瘤血管生成起重要作用，但目前尚未見相關研究報道。本文擬通過篩選MACC1表達較高的肺癌細胞株，化學合成MACC1基因特異性siRNA轉染該細胞，下調MACC1基因表達，觀察MACC1基因對肺癌細胞促進血管形成能力的影響，為研究MACC1基因在肺癌血管生成中的作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 A549，XWLC-05，GLC，SPC-A-1，YTMLC細胞由云南省腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所提供，1640培養(yǎng)基、胰酶/乙二胺回乙酸(EDTA)消化液、無血清Opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、LipofectamineTM 2000，Trizol總RNA提取試劑均購自Invitrogen公司。Quant cDNA第一鏈合成試劑盒購自北京天根生化公司，MACC1及內參上下游引物由蘇州金唯智生物公司合成，MACC1-siRNA 1～3及無義siRNA由廣州銳博生物有限公司合成，Platinum?SYBR?Green qPCR試劑盒購自Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1肺腺癌細胞的培養(yǎng)及傳代 復蘇A549，XWLC-05，GLC，SPC-A-1，YTMLC細胞株，加入含10% FBS的1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d進行常規(guī)換液傳代。

1.2.2RT-qPCR 法檢測細胞MACC1 mRNA的表達 采用Trizol 一步法提取各株細胞總RNA。取2 μg總RNA，參考逆轉錄反應試劑盒說明書進行cDNA第一鏈的合成。將逆轉錄合成的cDNA依照Platinum?SYBR?Green qPCR試劑盒說明書，行熒光定量PCR反應。MACC1(481 bp)正義：5′-TCGGTCAGGAAGAATTGC-3′。反義：5′-CTCTAAGTCGTGTAGTAGGAT-3′，β-actin(564 bp)正義：5′-CTGGGACGACATGGAGAAA-3′，反義：5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′。反應總體系25 μl，其中2.5×RealMasterMix/20×SYBR solution為12.5 μl，10 μmol/L正義各0.5 μl，模板為1 μl，超純水為10.5 μl。反應程序為：95℃預變性2 min，之后每一步95℃變性15 s；59.5℃退火30 s；72℃延伸30 s共35個循環(huán)。溶解曲線階段：95℃變性15 s；60℃退火 30 s；72℃延伸30 s。所有樣本均重復3次實驗，最后由隨機附帶軟件LCS480 1.5.039計算Ct值和拷貝數(shù)，2-△△CT分析法進行數(shù)值相對定量分析。

1.2.3MACC1 siRNA的設計合成 根據(jù)siRNA的設計原則，針對人MACC1 cDNA (序列編號: NM2003467)的編碼序列。設計3條不同的siRNA序列及1條陰性對照siRNA序列：siRNA-1：AAAGACAGAAGGAGAAAGGdTdT；siRNA-2：AATCAACTGTCTGCTTCTAdTdT；siRNA-3：AATTATATGCCAGGACAGCdTdT；NT-siRNA：AACAGTTATCTATGCGACAdTdT。

1.2.4細胞轉染及干擾效率的檢測 選擇MACC1 mRNA表達量最高的細胞進行后續(xù)實驗，采用含100 ml/LFBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。調整細胞濃度，接種無菌6孔板，每孔約1×105個細胞。待其生長至80%融合時，按照LipofectamineTM 2000脂質體轉染試劑盒說明書進行轉染操作。轉染前24 h將6孔板每孔加入Opti-MEM培養(yǎng)液2 ml。然后每孔加入siRNA-Lipofectamine 2000混合液500 μl，輕輕混勻，置于在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后更換成含血清的正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24、48、72 h收集細胞進行后續(xù)實驗。細胞分為空白對照組、無義siRNA轉染組和MACC1-siRNA 1～3轉染組。siRNA濃度為50～100 nmol/L為初步預實驗條件。

采用半定量RT-PCR方法于轉染后24 h時進行沉默效率的檢測?？俁NA提取和cDNA的合成采用之前的方法。MACC1和β-actin的引物同前。采用天根公司PCR-MasterMix對各轉染組進行半定量PCR。相同含量的PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色。采用Bio-rad公司的Quantity One軟件進行分析。β-actin作為歸一化內參。半定量RT-PCR檢測實驗重復3次。

1.2.5雞胚尿囊膜(CAM)檢測血管生成情況 72 h后收集各實驗組細胞上清液，選擇表面清潔、蛋殼均質、重量50～65 g、外形規(guī)范、氣室、氣孔均勻的種蛋為受試對象。孵育前用溫水(40℃～50℃)清洗2遍，以1∶1 000新潔爾滅溶液浸洗擦干。將種蛋置于(38.0±0.5)℃、相對濕度65%～70%的培養(yǎng)箱中孵化，在孵化過程中翻蛋2次/d，以防止胚胎發(fā)生粘連，并且促進雞羊膜運動， 每日用透射燈檢查胚胎發(fā)育情況，第3天無血管出現(xiàn)者淘汰出實驗，雞胚孵化第7天，在透射燈下觀察并確定CAM，將雞胚隨機分成三組，每組8只，用微量加樣器分別在CAM表面離開尿囊膜血管的空白處加100 μl的空白對照組上清液，100 μl MACC1-siRNA3組細胞培養(yǎng)上清液，100 μl無義siRNA組細胞培養(yǎng)上清液。繼續(xù)孵育48 h，暴露加藥區(qū)尿囊膜，滴入固定液(甲醇和丙酮1∶1)固定15 min，待CAM上的血管凝固后，剝離假氣室周圍的蛋殼，使CAM充分暴露，以載體為中心用眼科剪剪下約3 cm×3 cm的尿囊膜，平鋪于平皿中展開，晾干，置于顯微鏡下觀察。取出CAM放在濾紙上，并以濾紙為背景，在自然光線下用數(shù)碼相機采用近距離模式原位于光學顯微鏡相同物鏡倍數(shù)(×10)下觀察血管分支并攝片，參考文獻〔7〕中的分析方法對血管面積進行測定，計算面積比。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS16.0軟件進行分析，各肺癌細胞株中MACC1 mRNA的表達量與XWLC-05細胞之間的比較，不同MACC1-siRNA與無義siRNA組和對照組之間的比較，MACC1-siRNA實驗組CAM與無義siRNA組和對照組CAM之間的比較均應用單因素方差分析和t檢驗。

2 結 果

2.1RT-qPCR檢測各株細胞中MACC1 mRNA的表達情況 實時熒光定量PCR結果顯示，各株細胞中，XWLC-05細胞中MACC1的mRNA表達水平最高，SPC-A1肺腺癌細胞沒有檢測到MACC1 mRNA表達，提示其表達MACC1 mRNA的水平極低，其余各個細胞中MACC1 mRNA的表達量依次為A549>GLC>YTMLC。見表1。

2.2siRNA對XWLC-05細胞MACC1 mRNA 表達的影響 半定量RT-PCR結果顯示，各組可見亮度較均一的β-actin條帶，空白對照組及無義siRNA轉染組可見明顯的MACC1目的條帶，與空白對照組相比，轉染MACC1-siRNA1的XWLC005細胞中MACC1 mRNA的表達變化不太明顯，而MACC1-siRNA2和MACC1-siRNA3轉染組中的MACC1 mRNA表達水平明顯降低，其中MACC1-siRNA3的抑制率最高，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。因此選用該siRNA進行后續(xù)實驗。見圖2。

表1 各肺癌細胞株中MACC1mRNA的表達量

1～6:siRNA1,siRNA2,SiRNA3,NT-siRNA,Cont,Marker

2.3MACC1-siRNA對CAM血管生成的影響 三組細胞上清液對雞胚的存活率沒有顯著影響。形態(tài)學上觀察，無義siRNA組及空白對照組可見稍多的血管分支，而MACC1-siRNA組則多見長且粗的大血管，血管分支較少。MACC1-siRNA3組血管面積〔(5.82±0.74)%〕較無義siRNA組〔(9.54±1.11)%〕及空白對照組〔(10.03±0.49)%〕減少(P<0.05)；而無義siRNA組及空白對照組組間比較差異無顯著性(P>0.05)。見圖2。

對照組 無義siRNA組 MACCl-siRNA組

3 討 論

本研究結果說明了MACC1基因對肺癌細胞促進血管形成能力的影響，為進一步研究肺癌血管生成機制奠定了一定的實驗基礎。

腫瘤異質性理論認為，腫瘤是一個由具有不同遺傳背景的細胞亞群組成的異質性群體，在一個原發(fā)腫瘤細胞群中，并不是所有瘤細胞具有侵襲和轉移能力，這說明不同肺癌細胞之間具有不同的腫瘤異質性，而這種腫瘤異質性如遷移、黏附等生物學行為與不同肺癌細胞某些基因的突變有關。本實驗熒光定量PCR檢測顯示各肺癌細胞株細胞中MACC1 mRNA的表達不一致，在所檢測的五株肺癌細胞株中MACC1 mRNA的表達量依次為XWLC-05>A549>GLC>YTMLC> SPC-A1，MACC1在不同肺癌細胞中表達的差異性，可能是不同肺癌細胞具有不同的惡性生物學特性，如侵襲和轉移的原因之一。

Arlt等〔8〕發(fā)現(xiàn)MACCl表達水平上調者術后發(fā)生轉移或復發(fā)明顯增加。進一步研究顯示MACC1在良性向惡性轉化組織中的表達逐漸升高，原發(fā)或轉移性腫瘤中MACC1表達水平明顯增高，尤其在發(fā)生遠端轉移患者，其表達水平能反映原發(fā)腫瘤遠處轉移能力〔2,8〕。而腫瘤血管形成能為腫瘤細胞的播散提供最直接的通道，是腫瘤細胞遷移游走形成轉移的關鍵環(huán)節(jié)，本研究說明干擾MACC1后腫瘤細胞誘導微血管生成潛能明顯減弱，提示MACC1與宣威肺腺癌細胞株XWLC-05誘導微血管形成相關。

血管形成是促血管生成因子與抑制因子互相作用的結果，先前文獻報道腫瘤細胞本身可以合成分泌促血管生成因子包括多種生長因子如血管內皮生長因子(VEGF)家族、成纖維細胞生長因子(FGF)家族、血管生成素家族以及血管生成相關性趨化因子和細胞因子如白細胞介素(IL-8)等，誘導血管生成。而這些促血管生成因子的分泌受HGF/c-MET調節(jié)，作為HGF/c-MET信號通路的關鍵調節(jié)因子MACC1能有效降低宣威肺腺癌細胞XWLC-05誘導CAM微血管形成的能力，其具體調控機制如何需要進一步研究。

4 參考文獻

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2Stein U,Walther W,Arlt F,etal.MACC1,a newly identified key regulator of HGF-MET signaling,predicts colon cancer metastasis〔J〕. Nat Med,2009;15(1):59-67.

3Stein U,Dahlmann M,Walther W. MACC1 - more than metastasis? Facts and predictions about a novel gene〔J〕. J Mol Med (Berl),2010;88(1):11-8.

4Shimokawa H,Uramoto H,Onitsuka T,etal.Overexpression of MACC1 mRNA in lung adenocarcinoma is associated with postoperative recurrence〔J〕. J Thorac Cardiovasc Surg,2011;141(4):895-8.

5Shirahata A,Fan W,Sakuraba K,etal.MACC 1 as a marker for vascular invasive hepatocellular carcinoma〔J〕. Anticancer Res,2011;31(3):777-80.

6Chundong G,Uramoto H,Onitsuka T,etal.Molecular diagnosis of MACC1 status in lung adenocarcinoma by immunohistochemical analysis〔J〕.Anticancer Res,2011;31(4):1141-5.

7許 揚,趙英凱,畢明剛,等.Image-Pro Plus圖像分析軟件定量雞胚尿囊膜血管新生面積的方法〔J〕.中國比較醫(yī)學雜志,2007;17(12):745-7,封3.

8Arlt F,Stein U. Colon cancer metastasis: MACC1 and Met as metastatic pacemakers〔J〕.Int J Biochem Cell Biol,2009;41(12):2356-9.