陳鳳云 胡小青

TGF-β/Smads信號(hào)通路中的信號(hào)由細(xì)胞核外進(jìn)入核內(nèi)要借助于Smads家族中的核心成員Smad4的核轉(zhuǎn)運(yùn)功能。若Smad4突變或缺失，整個(gè)TGF-β超家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)就會(huì)被破壞，胞外信號(hào)無(wú)法轉(zhuǎn)運(yùn)入核，使得下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)不受控制，導(dǎo)致增殖與分化失衡，形成腫瘤。有研究證實(shí)P21WAF1/CIP1是TGF-β/Smads信號(hào)通路的下游靶基因，P21WAF1/CIP1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性受Smad4的調(diào)控，當(dāng)Smad4羧基末端被截?cái)嗪?，P21WAF1/CIP1的表達(dá)嚴(yán)重下降[1-2]。多數(shù)研究者認(rèn)為TGF-β/Smads信號(hào)通路對(duì)于正常卵巢上皮的生長(zhǎng)調(diào)控是至關(guān)重要的，若此信號(hào)通路及其下游靶基因遭到破壞時(shí)則可能導(dǎo)致卵巢癌的發(fā)生[3-6]。我們以卵巢上皮腫瘤組織中Smad4上游信號(hào)正常為假設(shè)前提,探討Smad4蛋白及其下游信號(hào)在卵巢上皮腫瘤由良性向惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用及相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2007年1月-2009年12月江西省婦幼保健院收治的行手術(shù)切除的89例卵巢組織標(biāo)本存檔蠟塊，患者術(shù)前均未行任何治療，均有完整的臨床病理資料，均經(jīng)病理檢查確診，并由兩位主治級(jí)別以上的病理醫(yī)師復(fù)查HE切片核實(shí)病理診斷。卵巢上皮癌按FIGO2000分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期。

卵巢上皮良性腫瘤組24例：漿液性囊腺瘤14例，黏液性囊腺瘤10例,年齡19～54歲。卵巢上皮交界性腫瘤組22例：漿液性交界瘤8例，黏液性交界瘤14例,年齡23～58歲。

卵巢上皮癌組43例，均為原發(fā)癌，年齡30～68歲，中位年齡50歲。病理類型：漿液性囊腺癌18例，黏液性囊腺癌10例，子宮內(nèi)膜樣癌15例。臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期23例，Ⅲ～Ⅳ期20例。組織學(xué)分化：高分化(G1)9例，中低分化(G2-3)34例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例。

1.2 主要試劑及方法

Smad4(SC-7966)為濃縮型單克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司(由北京中杉金橋公司代購(gòu))；P21WAF1/CIP1(ZM-0206)為即用型單克隆抗體,P21WAF1/CIP1抗體及SP試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

采用S-P兩步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

Smad4蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì),也有少量位于細(xì)胞核中;P21WAF1/CIP1蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞核;以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。選擇染色均勻的腫瘤區(qū)域,在 400 倍視野下計(jì)數(shù)著色細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比,共計(jì)數(shù) 10個(gè)視野,取平均值。① 按著色細(xì)胞占視野細(xì)胞總數(shù)的比例分為 0～3級(jí)：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0 級(jí)；< 25 %為1級(jí);25%～50 %為2級(jí);>50 %為3級(jí)。② 按染色強(qiáng)弱分:0 級(jí)，陰性;1級(jí)，弱;2級(jí)，中;3 級(jí)，強(qiáng)。按 ①與②級(jí)數(shù)之和判斷結(jié)果，以0～6表示：0～2 為(-);3～4為(+);5～6為(++)。(-)和(+)為陰性組,(++)為陽(yáng)性組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，小樣本資料采用Fisher確切概率法。相關(guān)性應(yīng)用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)中的Spearman等級(jí)相關(guān)性分析。P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Smad4在卵巢上皮良性腫瘤、卵巢上皮交界性腫瘤及卵巢上皮癌組織中的表達(dá)(表1)

表1 Smad4蛋白在卵巢上皮良性腫瘤、卵巢上皮交界性腫瘤及卵巢上皮癌組織中的表達(dá)(例，%)

卵巢上皮良性腫瘤與卵巢上皮交界性腫瘤組織Smad4陽(yáng)性表達(dá)率比較，P>0.05；卵巢上皮交界性腫瘤與卵巢上皮癌組織Smad4陽(yáng)性表達(dá)率比較，P>0.05；卵巢上皮癌與卵巢上皮良性腫瘤組織Smad4陽(yáng)性表達(dá)率比較，P>0.05。

2.2 Smad4蛋白表達(dá)與卵巢上皮癌臨床病理特征的關(guān)系(表2)

Smad4蛋白表達(dá)與卵巢上皮癌的FIGO分期、組織學(xué)類型，病理分化及淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性。

表2 Smad4蛋白表達(dá)與卵巢上皮癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 P21WAF1/CIP1在卵巢組織中的表達(dá)

P21WAF1/CIP1在卵巢上皮良性腫瘤、卵巢上皮交界性腫瘤及卵巢上皮癌組織中的表達(dá)見表3。

表3 P21WAF1/CIP1蛋白在卵巢上皮良性腫瘤、卵巢上皮交界性腫瘤及卵巢上皮癌組織中的表達(dá)(例，%)

卵巢上皮良性腫瘤與卵巢上皮交界性腫瘤組織Smad4陽(yáng)性表達(dá)率比較，P>0.05；卵巢上皮交界性腫瘤與卵巢上皮癌組織Smad4陽(yáng)性表達(dá)率比較，P>0.05；卵巢上皮癌與卵巢上皮良性腫瘤組織Smad4陽(yáng)性表達(dá)率比較，P>0.05。

2.4 P21WAF1/CIP1蛋白表達(dá)與卵巢上皮癌臨床病理特征的關(guān)系(表4)

P21WAF1/CIP1蛋白表達(dá)與卵巢上皮癌的FIGO分期及病理分化密切相關(guān)，與其組織學(xué)類型及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性，見表4。

表4 P21WAF1/CIP1蛋白表達(dá)與卵巢上皮癌臨床病理特征的關(guān)系

2.5 卵巢上皮癌組織中Smad4及P21WAF1/CIP1蛋白表達(dá)的相關(guān)性

43例卵巢上皮癌組織中,Smad4及P21WAF1/CIP1同時(shí)呈陽(yáng)性表達(dá)13例；同時(shí)呈陰性表達(dá)6例；22例Smad4呈陽(yáng)性表達(dá)而P21WAF1/CIP1呈陰性表達(dá)；有2例Smad4呈陰性表達(dá)而P21WAF1/CIP1呈陽(yáng)性表達(dá)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，Smad4及P21WAF1/CIP1蛋白在卵巢上皮癌組織中的表達(dá)無(wú)相關(guān)性(Rs=0.099,P>0.05)。

3 討論

Smad4,又稱DPC4(Deleted in pancreatic cancer 4)，位于染色體18q21.1上，是研究胰腺癌時(shí)發(fā)現(xiàn)大多數(shù)標(biāo)本的18號(hào)染色體長(zhǎng)臂上存在雜合性缺失(loss of heterozygosity LOH)，予命名為DPC4(Deletedin Pancreatic Cancer4)基因。后來(lái)發(fā)現(xiàn)DPC4蛋白與果蠅的MAD和線蟲的Sma2、Sma3、Sma4蛋白屬同源蛋白，都是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)超家族信號(hào)傳導(dǎo)的成員，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，所以后來(lái)將這類蛋白統(tǒng)稱為Smads蛋白，故DPC4也稱為Smad4。Smad4作為Smad家族的核心成員，既是TGF-β超家族受體的直接底物，又是將受體信號(hào)傳遞導(dǎo)核內(nèi)的遞質(zhì)。若Smad4突變或缺失，整個(gè)TGF-β超家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)就會(huì)被破壞，胞外信號(hào)無(wú)法轉(zhuǎn)運(yùn)入核，使得下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)不受控制，導(dǎo)致增殖與分化失衡，最終形成腫瘤。有報(bào)道Smad4在其腦膠質(zhì)瘤、大腸癌、肝癌、宮頸癌等多種腫瘤中都有不同程度表達(dá)下調(diào)[7-10]。Heini等[11]通過(guò)等位基因分析后認(rèn)為，18q21.1近端區(qū)域的Smad4、Smad2、DDC為卵巢癌抑癌基因，三者中一個(gè)或一個(gè)以上的等位基因突變或缺失在卵巢上皮癌的形成事件中占有相當(dāng)大的作用。本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，假定卵巢上皮腫瘤組織中TGF-β受體正常的前提下，對(duì)89例卵巢腫瘤組織進(jìn)行Smad4蛋白檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)Smad4的缺失并不是卵巢上皮癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵原因。

P21CIP1是尋找細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶調(diào)節(jié)蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)的1種可與其相互作用的蛋白，與野生型P53蛋白激活因子為同一基因，又稱為P21WAF1/CIP1基因，是P53重要的下游基因。當(dāng)細(xì)胞受到各種損傷后，野生型P53通過(guò)P21WAF1/CIP1上游2.4kb和8kb處的P53蛋白特異性結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合并表達(dá)產(chǎn)生P21WAF1/CIP1蛋白，這是依賴P53途徑的功能。P21還有非依賴P53途徑的功能，即P53通路破壞時(shí)，P21WAF1/CIP1蛋白可以在TGF-β/Smads通路中的信號(hào)刺激而高表達(dá)[12]；這是因?yàn)樵谄涞诙€(gè)外顯子的近端區(qū)域(-124/-61)間含有多個(gè)構(gòu)成性轉(zhuǎn)錄協(xié)同因子SP1結(jié)合位點(diǎn)，它能與結(jié)合在Smad2/3/4的MH1區(qū)域上的SP1結(jié)合，而誘導(dǎo)P21WAF1/CIP1蛋白的表達(dá)。本研究與Annette等研究相符[13]，這些數(shù)據(jù)表明在卵巢上皮腫瘤由良性向惡性轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，P21WAF1/CIP1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率逐漸下降；在卵巢上皮癌組織中，病理分化越低、臨床分期越晚，P21WAF1/CIP1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率越低；提示P21WAF1/CIP1蛋白的缺失與卵巢上皮腫瘤的惡性進(jìn)展關(guān)系密切。

多數(shù)研究者認(rèn)為，在胰腺癌、肝癌及乳腺癌等惡性腫瘤中P21WAF1/CIP1為Smad4的下游靶基因，其表達(dá)水平受Smad4蛋白的調(diào)控，并與Smad4的表達(dá)水平呈正相關(guān)；若上游的Smad4蛋白表達(dá)下降，P21WAF1/CIP1的表達(dá)水平也相應(yīng)下降，其抑制細(xì)胞周期的活性也隨著降低，使DNA復(fù)制失控，最終導(dǎo)致細(xì)胞癌變的發(fā)生。但是在我們的研究中發(fā)現(xiàn)：在卵巢上皮腫瘤由良性向惡性進(jìn)展的過(guò)程中，Smad4蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變，而P21WAF1/CIP1蛋白的表達(dá)則有一個(gè)下降的過(guò)程。這表明Smad4蛋白的缺失可能并不是卵巢上皮腫瘤惡性進(jìn)展的關(guān)鍵原因;且卵巢上皮惡性腫瘤組織中P21WAF1/CIP1蛋白的表達(dá)并不受Smad4蛋白表達(dá)的調(diào)控?？傊琓GF-β所介導(dǎo)的TGF-β/Smads信號(hào)通路在卵巢上皮癌中不能正常發(fā)揮生長(zhǎng)抑制作用，不是因?yàn)镾mad4蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙，可能是由于Smad4蛋白的上游信號(hào)異常所致。在下一步的研究工作中，我們將對(duì)卵巢上皮癌組織中Smad4蛋白的上游信號(hào)再行研究，以探討此信號(hào)通路中其它組成成分在卵巢上皮癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。

[1] Qin H,Chan MW,Liyanarachchi S，et al.An integrative ChIP-chip and gene expression profiling to model SMAD regulatory modules〔J〕.BMC Syst Biol，2009，3:73.

[2] Pardali K,Kowanetz M,Heldin CH,et al.Smad pathway-specific transcriptional regulation of the cell cycle inhibitor P21WAF1/CIP1〔J〕.J Cell Physiol，2005，182(2):205-212.

[3] Rodriguez GC,Haisley C,Hurteau J,et al.Regulation of Invasion of Epithelial Ovarian Cancer by Transforming Growth Factor-β〔J〕.Gynecol Oncol，2001，80(2):245-253.

[4] Chen T,Triplett J,Dehner B,et al.Transforming Growth F-actor-β Receptor Type I Gene Is Frequently Mutated in Ovarian Carcinomas〔J〕.Cancer Res，2001，61(12):4679-4682.

[5] Toutirais O,Chartier P,Dubois D,et al.Constitutive expres

sion of TGF-beta1,interleukin-6 and interleukin-8 by tumor cells as a major component of immune escape in human ovarian carcinoma〔J〕.Eur Cytokine Netw，2003，14(4):246-255.

[6] Wang D,Kanuma T,Mizunuma H,et al.Analysis of Specific Gene Mutations in the Transforming Growth Factor-β Signal Transduction Pathway in Human Ovarian Cancer〔J〕.Cancer Res，2000，60(16):4305-4310.

[7] Kjellman C，Olofsson S，Hansson O,et al.Expression of T-GF-beta isoforms，TGF-beta receptors，and SMAD molecules at different stages of human glioma〔J〕.Int J Cancer，2000，89(3)：251-258.

[8] Woodford-Richen K,Rouwan A,Gorman P,et al.SMAD4 -mutations in colorectal cancer probably occur before chromosomal instability,but after divergence of the microsatellite instability pathway〔J〕.PNAS，2001，99(17):9719-9723.

[9] Amin R,Mishra L.Liver Stem Cells and TGF-β in Hepatic Carcinogenesis〔J〕.Gastrointest Cancer Res，2008，2(4):S27-S30.

[10] Ki KD,Tong SY,Huh CY,et al.Expression and mutational analysis of TGF-β/Smads signaling in human cervical cancers〔J〕.Gynecol Oncol，2009，20(2):117-121.

[11] Lassus H,Salovaara R,Aaltonen LA,et al.Allelic Analysis of Serous Ovarian Carcinoma Reveals Two Putative Tumor Suppressor Loci at 18q22-q23 Distal to SMAD4,SMAD2,and DCC〔J〕.Am J Pathol，2001，159(1):35-42.

[12] Barbareschi M,Caffo O,Doglioni C,et al.P21waf1 immunohistochemical expression in breast carcinoma:correlations with P53-independent expression and association with tumoral differentiation〔J〕.Oncogene，2003，12(6):1391-1324.

[13] Schmider-Ross A,Pirsig O,Gottschalk E,et al.Cyclin-dependent kinase inhibitors CIP1 (p21) and KIP1 (p27) in ovarian cancer〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol，2006，132(3):163-170.