陳曉軍 劉勝春

隨著醫(yī)療水平的提高，早期胃癌的診斷率日益增高，手術(shù)是其最有效的治療手段，但術(shù)后仍有部分患者會復(fù)發(fā)，主要是由淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移所致。LMO4、DLEC1已被認(rèn)為在消化道惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中起重要作用,但LMO4、DLEC1與早期胃癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移之間關(guān)系的臨床意義尚未清楚。本研究通過免疫組化方法前瞻性研究50例早期胃癌患者淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移與原發(fā)灶LMO4、DLEC1的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本研究中50例早期胃癌組織標(biāo)本取自我院普外科2007年6月-2010年2月手術(shù)標(biāo)本,其中男性31例,女性19例;年齡37～71歲,平均55.6歲；按組織學(xué)分類:高分化20例，中分化13例，低分化14例，印戒細(xì)胞3例；按腫瘤部位分類：胃體8例，胃竇42例；按侵犯深度分類：黏膜層11例，黏膜肌層17例，黏膜下層22例；按淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分類：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移3例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例。納入標(biāo)準(zhǔn)：本組資料全部組織標(biāo)本獲取前未經(jīng)放療和化療，有詳細(xì)的臨床資料，所有患者均行標(biāo)準(zhǔn)的胃癌D2根治術(shù)。

1.2 主要試劑

LMO4和DLEC1兔抗人多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，SP 免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒及磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自武漢博士德生物工程有限公司。亞甲藍(lán)購自美國Gibco公司，細(xì)胞角蛋白(cytokeratin,CK)單抗鼠抗CK-20蛋白購自美國Cell signaling公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

1.3.1 淋巴結(jié)免疫染色 全組50例早期胃癌患者術(shù)后標(biāo)本共采集到1 225枚淋巴結(jié),平均每例24.5枚，分別進(jìn)行常規(guī)HE染色和CK免疫組化染色，以標(biāo)準(zhǔn)SAB免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行CK染色，腫瘤及淋巴結(jié)標(biāo)本用10%甲醛固定和石蠟包埋，石蠟切片脫蠟、水化、3%過氧化氫、EDTA溶液修復(fù)抗原后、山羊血清封閉后,滴加CK抗體(1∶500工作濃度)，沖洗并滴加辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗,并以DAB顯色,以亞甲藍(lán)進(jìn)行背景染色,以PBS作為陰性對照。

1.3.2 LMO4和DLEC1免疫組化檢測 采用免疫組化 SP 法，并用 DAB 顯色。所有標(biāo)本均采用高溫高壓修復(fù)抗原，并按照試劑說明書進(jìn)行染色。用已知的陽性切片作為陽性對照，PBS 代替一抗作為陰性對照。

1.4 染色結(jié)果判定

所有結(jié)果由兩位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師對染色切片進(jìn)行診斷，CK染色表現(xiàn)為黃棕色顆粒，只在CK染色中發(fā)現(xiàn),但HE染色未能診斷的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移稱為微轉(zhuǎn)移。

LMO4蛋白陽性染色表現(xiàn)為細(xì)胞核呈棕黃色或者棕褐色。根據(jù)視野中染色的細(xì)胞所占百分比評估染色的強(qiáng)度，分為3個等級：55%以下表示輕度及以下染色，>55%～70%為中度染色，>70%為強(qiáng)度染色。定義染色等級<55%的是低表達(dá)，≥55%即認(rèn)為是高表達(dá)。

DLEC1蛋白陽性染色表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或者棕褐色，根據(jù)視野中染色的細(xì)胞所占百分比評估染色的強(qiáng)度，分為4個等級：0～5%為-，≥6%～25%為+，≥26%～50%為++，>50%為+++。“-，+”為低表達(dá)，“++，+++”為高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用χ2檢驗、確切概率法及Spearman等級相關(guān)分析法。用Kaplan-Meier法繪制5年生存曲線,P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況

50例早期胃癌患者中,HE 染色發(fā)現(xiàn)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移2例，而 CK 免疫組化染色發(fā)現(xiàn)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例,兩種方法淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.597,P<0.05)；在全部1 225枚淋巴結(jié)中,淋巴結(jié)受累率HE染色發(fā)現(xiàn)的為7枚，而CK免疫組化染色發(fā)現(xiàn)的淋巴結(jié)受累率為25枚,兩種方法淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=33.793，P<0.05)。

2.2 早期胃癌臨床病理因素與淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的關(guān)系

在50例早期胃癌中黏膜內(nèi)癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為9.1%(1/11)，黏膜肌層癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為11.8%(2/17)，黏膜下癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為40.9%(9/22)，淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移與侵犯深度有顯著相關(guān)性(P<0.05)；高分化癌發(fā)現(xiàn)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為5.0%(1/20)，中分化癌發(fā)現(xiàn)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為15.4 %(2/13)，低分化癌發(fā)現(xiàn)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為57.1 %(8/14)，印戒細(xì)胞癌發(fā)現(xiàn)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為33.3%(1/3)，淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移與侵犯程度有顯著相關(guān)性(P<0.05)，但與腫瘤直徑、腫瘤部位無相關(guān)性。見表1。

表1 早期胃癌臨床病理資料及淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的關(guān)系(例，%)

2.3 LMO4、DLEC1在早期胃癌中的表達(dá)

早期胃癌組織中LMO4表達(dá)與浸潤深度、淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移、組織分化程度、腫瘤大小呈明顯正相關(guān)(P<0.05)，DLEC1表達(dá)與浸潤深度、淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移、組織分化程度、腫瘤大小呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.05)。兩者表達(dá)均與患者的年齡、性別無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 早期胃癌組織中LMO4、DLEC1表達(dá)/例

注：*為與高表達(dá)組相比較，P<0.05。

2.4 LMO4、DLEC1在早期胃癌組織中表達(dá)的關(guān)系

在早期胃癌組織中LMO4與DLEC1蛋白表達(dá)經(jīng)Spearman等級相關(guān)性分析，結(jié)果顯示,LMO4與DLEC1蛋白存在負(fù)相關(guān)(γ=-0.788,P=0.001)。見表3。

表3 在早期胃癌組織中LMO4、DLEC1的關(guān)系/例

2.5 早期胃癌患者的預(yù)后

早期胃癌患者5 年生存率為96.0%，平均時間35.2個月(28～60個月)。按早期胃癌患者的淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移分為微淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無微淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。根據(jù)生存分析法分析微淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的無瘤中位生存時間為32.5個月，無微淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的無瘤中位生存時間為38.8個月，兩者無瘤生存率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.068)。

3 討論

每年全球新發(fā)胃癌100余萬例，死亡約80萬例，中國占35%，發(fā)病率和死亡率均是世界平均水平的兩倍多。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子LMO4、DLEC1與胃癌的發(fā)生發(fā)展及患者的預(yù)后是否存在相關(guān)性，其病因、發(fā)病機(jī)制和浸潤轉(zhuǎn)移的信號傳導(dǎo)機(jī)制等仍尚未明確。如何有效地阻止腫瘤的發(fā)生轉(zhuǎn)移及改善患者預(yù)后生活質(zhì)量已成為現(xiàn)今學(xué)者研究的方向。人類基因組編碼4個 LMO (lim domain only)蛋白，分別是 LMO1-LMO4，LMO4 作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子亞家族 LMO中的一員是最后被發(fā)現(xiàn)的，其在細(xì)胞分化決定、組織形成、器官發(fā)育中起到了重要作用[1-4]。EMT是胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)轉(zhuǎn)分化的基礎(chǔ)，同時也是腫瘤細(xì)胞演進(jìn)與遷移的基礎(chǔ)，而LMO4的表達(dá)也集中在EMT活躍的區(qū)域，其可能參與了EMT中信號通路的調(diào)節(jié)，在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[5-6]。已有不少研究[7-12]發(fā)現(xiàn)在人類多種腫瘤中DLEC1均有異常表達(dá)，且體外實驗也顯示其可以抑制細(xì)胞聚集和生長，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，在細(xì)胞生長過程中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用[13]。劉艷華等[8-9]實驗結(jié)果顯示，DLEC1在肺癌中表達(dá)下調(diào)，且其表達(dá)與組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)，提示DLEC1基因的失活與NSCLC的發(fā)生發(fā)展可能具有相關(guān)性。葉曉兵等[10]用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP) 檢測DLEC1基因在結(jié)直腸癌患者組織和血清中的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)在CRC 組織和血清DNA 中，DLEC1 基因啟動子甲基化比例均高于對照組，且組織和血清DNA中具有良好的一致性。數(shù)據(jù)顯示，在CRC 患者中DLEC1 基因有著較高的檢出率。至今尚未有關(guān)于LMO4、DLEC1與早期胃癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移方面的文獻(xiàn)，因此本研究通過免疫組織化學(xué)檢測LMO4、DLEC1在早期胃癌中的表達(dá)情況。

經(jīng)免疫組化染色，LMO4 蛋白細(xì)胞核呈棕黃色或者棕褐色，DLEC1 蛋白的細(xì)胞漿呈棕黃色或者棕褐色。實驗結(jié)果顯示，在50例早期胃癌中黏膜內(nèi)癌、黏膜肌層癌、黏膜下癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率分別為9.1%、11.8%、40.9%；且高分化癌、中分化癌、低分化癌、印戒細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率分別為5.0%、15.4%、57.1%、33.3%，證實了淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移與侵犯深度，與組織學(xué)類型有顯著相關(guān)性。腫瘤浸潤深度越深，惡性程度越高，淋巴結(jié)內(nèi)轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞數(shù)量可能就越多，提示淋巴管受侵犯情況與淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性[14]。早期胃癌組織中LMO4、DLEC1的表達(dá)與患者的年齡、性別均無關(guān)。LMO4與臨床病理因素如浸潤深度、淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移、組織分化程度、腫瘤大小呈明顯正相關(guān)，證實在早期胃癌中LMO4在有淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的病例中高表達(dá)，即 LMO4在有淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移組中高表達(dá)，提示可能其參與了胃癌的轉(zhuǎn)移侵襲。而DLEC1與浸潤深度、淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移、組織分化程度、腫瘤大小有較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，在淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移組的表達(dá)明顯低于無淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移組，提示DLEC1對臨床預(yù)后判斷具有重要意義。經(jīng)Spearman等級相關(guān)性分析，LMO4 和 DLEC1 兩者之間存在相關(guān)關(guān)系，呈負(fù)性相關(guān)。通過生存分析發(fā)現(xiàn)，早期胃癌患者的5年生存率為96.0%。分析結(jié)果顯示，無微淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的無瘤中位生存時間為38.8個月，高于微淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。說明淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移可能造成淋巴結(jié)內(nèi)以聚集形式出現(xiàn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，進(jìn)而向更遠(yuǎn)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，影響患者的生存率。

綜上所述， LMO4 及 DLEC1 基因與胃癌的發(fā)病機(jī)制和浸潤轉(zhuǎn)移有一定的相關(guān)性。聯(lián)合檢測兩基因可能對胃癌的早期診斷及預(yù)后監(jiān)測具有重要意義。

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