李淑梅 黃章敏 陳良龍

基礎(chǔ)研究

阿托伐他汀對(duì)冠狀動(dòng)脈微栓塞后心肌炎癥的影響

李淑梅 黃章敏 陳良龍

目的探討阿托伐他汀干預(yù)治療對(duì)冠狀動(dòng)脈微栓塞（CME）后心肌炎癥的影響。方法48只清潔級(jí)雄性SD大鼠經(jīng)左心室內(nèi)注射自體微血栓，同時(shí)短暫夾閉主動(dòng)脈，建立大鼠CME模型后，隨機(jī)分為未治療組及阿托伐他?。ˋtrovastatin）干預(yù)組，于術(shù)后7 d處死。HE染色觀察梗死心肌，免疫組織化學(xué)染色及Western blot檢測(cè)腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）及細(xì)胞間黏附因子1（ICAM-1）等炎癥因子在心肌中表達(dá)的變化。結(jié)果阿托伐他汀可輕度減少梗死面積，顯著抑制CME后心肌中白細(xì)胞浸潤及TNF-α、IL-6、ICAM-1蛋白表達(dá)（P均＜0.05）。結(jié)論阿托伐他汀能顯著抑制CME后心肌炎癥反應(yīng)。

冠脈微栓塞； 腫瘤壞死因子α； 白介素6； 細(xì)胞間黏附因子1； 他汀

冠脈微栓塞（CME）在缺血性心臟病、急性冠脈綜合征（ACS）、溶栓治療、冠脈介入治療（PCI）中是常見而重要的臨床事件[1]。眾多的臨床資料及試驗(yàn)研究顯示，炎癥反應(yīng)在CME病變中占重要位置。對(duì)極大可能發(fā)生CME的不穩(wěn)定型心絞痛和ACS患者觀察發(fā)現(xiàn)，其血清C反應(yīng)蛋白（CRP）、白介素6（IL-6）明顯升高[2，3]；CME 病理上呈現(xiàn)白細(xì)胞浸潤、多中心微梗灶形成等炎癥反應(yīng)特征。CME炎癥反應(yīng)不僅局限微梗塞區(qū)，同時(shí)累及許多“正?！毙募　kyschally等[4]提出抗炎治療有望成為CME的治療策略。研究表明，他汀類藥物可有效減輕全身及心血管炎癥[5]。本研究應(yīng)用免疫組化、蛋白質(zhì)印跡分析等方法，觀察阿托伐他汀對(duì)CME伴發(fā)心肌炎癥的影響，為預(yù)防缺血性心臟病的發(fā)生尋找有效干預(yù)措施提供新依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑 清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量280～320 g，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。羊抗大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）抗體購自Santa Cruz公司（美國），羊抗大鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6）、細(xì)胞間黏附因子-1（ICAM-1）抗體購自R&D公司（美國），原位雜交試劑盒、SP免疫組化試劑盒、AEC染色試劑盒、BCIP/NBT顯色試劑盒均購自北京中山生物技術(shù)有限公司。阿托伐他?。ˋtrovastatin）由輝瑞制藥公司提供。

1．2 動(dòng)物分組及模型建立[6]SD大鼠48只，分為CME組（24只）和CME+Atrovastatin治療組（24只）。CME組以5 mg微血栓中加入0.3 ml PBS后劇烈震蕩制成混懸液左心室腔內(nèi)注射造模；Atrovastatin治療組在CME組的基礎(chǔ)上，阿托伐他汀20 mg/kg灌胃給藥。于術(shù)后第7天處死大鼠，將心臟常規(guī)液氮保存。

1．3 微梗死面積及白細(xì)胞記數(shù) 取乳頭肌段心室肌，10%甲醛固定，石蠟包埋，標(biāo)本按3μm厚度系列切片，每標(biāo)本切6張。行心肌HE染色，相差顯微鏡下通過圖像處理軟件計(jì)算心肌梗死面積占總面積的比值；每個(gè)切面隨機(jī)選取10個(gè)視野（73 800μm2）記數(shù)浸潤的白細(xì)胞。

1．4 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)TNF-α、IL-6、ICAM-1等炎癥因子在心肌中的表達(dá) 采用SP-ABC法，具體步驟是：染色切片常規(guī)脫蠟至水，0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液微波抗原修復(fù)，3%H2O2去離子水抗內(nèi)源性過氧化物酶，加入血清，室溫封閉20 min，山羊抗大鼠 TNF-α、IL-6、ICAM-1（1∶200 稀釋）抗體置濕盒4℃過夜；依次加入生物素標(biāo)記的二抗及鏈霉親和素-過氧化物酶溶液，室溫10 min，AEC顯色，蘇木素輕度復(fù)染。顯微鏡觀察胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)紅色顆粒的細(xì)胞為TNF-α、IL-6、ICAM-1陽性表達(dá)細(xì)胞。用Image-ProPlus圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖片處理，隨機(jī)選取每張切片20個(gè)視野，測(cè)定其陽性染色的平均光密度值（IOD）。IOD值越高表明組織抗原含量越高；20個(gè)視野的平均值作為該切片的IOD值。

1．5 Western blot檢測(cè)心肌組織 TNF-α、IL-6、ICAM-1蛋白表達(dá) 取100 mg心肌組織，采用蛋白提取試劑盒按說明書提取胞漿蛋白，以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，Bradford法測(cè)定蛋白濃度。樣品蛋白與加樣緩沖液等體積混勻，每份樣品上樣總蛋白50μg。8%分離膠，5%濃縮膠，SDS-PAGE凝膠恒壓電泳。電泳結(jié)束后，應(yīng)用半干電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入1∶500稀釋的一抗于4℃孵育過夜。TBS洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記相應(yīng)二抗及內(nèi)參HRP-GAPDH 37℃孵育1 h。TBS洗滌后應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法顯色，用GSD8000密度掃描分析系統(tǒng)（英國UVP公司）進(jìn)行圖像分析，以TNF-α、IL-6、ICAM-1與GAPDH條帶的吸光面積積分比值IOD評(píng)定其蛋白表達(dá)水平。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。結(jié)果以±s表示，多組間比較采用one-way ANOVA分析和Dunnett-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水平（α）為0.05。

2 結(jié)果

2.1 阿托伐他汀對(duì)微梗死面積及白細(xì)胞心肌浸潤的影響 阿托伐他汀可輕度減少微梗死面積，顯著降低白細(xì)胞浸潤（P＜0.01）。見表1。

表1 阿托伐他汀對(duì)微梗死面積及白細(xì)胞心肌浸潤的影響（±s）

表1 阿托伐他汀對(duì)微梗死面積及白細(xì)胞心肌浸潤的影響（±s）

注：與 CME 組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

組別 梗死面積 WBC（/mm2）CME 組 16.29±2.13 755±106 Atrovastatin 組 14.38±1.64a 389±79b

2.2 阿托伐他汀對(duì)CME后TNF-α、IL-6、ICAM-1在心肌組織表達(dá)的影響 見圖1～3，表2。術(shù)后7 d CME組TNF-α除了在微梗灶內(nèi)殘留的和周邊區(qū)缺血的心肌細(xì)胞、部分“正?！毙募〖?xì)胞陽性表達(dá)，血管周TNF-α陽性炎性細(xì)胞滲出明顯增多（圖1 A、B）。阿托伐他汀治療后在梗死灶邊心肌及其他正常心肌表達(dá)減弱，炎性細(xì)胞滲出減少（圖1 C、D）。

表2 阿托伐他汀干預(yù)后心肌中TNFα、IL-6及ICAM-1 的變化（±s）

表2 阿托伐他汀干預(yù)后心肌中TNFα、IL-6及ICAM-1 的變化（±s）

注：與CME組比較，aP＜0.05

組別 例數(shù) TNF-α IL-6 ICAM-1 CME 組 24 31.15±7.72 40.33±6.12 3.15±0.34 Atrovastatin 組 24 17.00±2.37a 21.83±2.48a 1.99±0.17a

CME后IL-6在小血管出現(xiàn)強(qiáng)表達(dá)，在血管壁上出現(xiàn)IL-6陽性的炎性細(xì)胞大量滲出、游走現(xiàn)象；同時(shí)在微梗灶內(nèi)殘留的和周邊區(qū)缺血的心肌細(xì)胞、部分血管周圍心肌細(xì)胞也有表達(dá)（圖2 A、B）。阿托伐他汀治療后在梗死灶邊心肌及其他正常心肌、血管內(nèi)皮表達(dá)減弱（圖2 C、D）。

CME組ICAM-1在血管內(nèi)皮及微梗死灶心肌表達(dá)增強(qiáng)（圖3 A）。阿托伐他汀可抑制血管內(nèi)皮及心肌中ICAM-1表達(dá)（圖3 B）。

2.3 Western blot結(jié)果 Western blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，阿托伐他汀可抑制CME后TNF-α、IL-6、ICAM-1在心肌中表達(dá)（圖4）。

圖4 Western blot檢測(cè)Atrovastatin對(duì)心肌中TNF-α、IL-6及ICAM-1表達(dá)的影響

3 討論

CME伴發(fā)炎癥反應(yīng)已在多項(xiàng)研究中得到證實(shí)，且炎癥反應(yīng)是引起CME心肌收縮功能低下的最重要機(jī)制。反復(fù)、多次發(fā)生CME可導(dǎo)致微梗死、心律失常、冠脈儲(chǔ)備功能下降、左室重構(gòu)甚至心力衰竭[1]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，急性-亞急性期除了微梗灶周圍存活的心肌，在血管內(nèi)皮、部分“正?！毙募〖安糠中⊙苤苓呅募【霈F(xiàn)炎癥因子如TNF-α、IL-6和ICAM-1的表達(dá)，炎癥細(xì)胞大量滲出。因此，CME炎癥并不是僅局限于微梗灶及周圍，同時(shí)導(dǎo)致微循環(huán)炎癥激活，波及到許多“無辜心肌”，產(chǎn)生“旁觀者效應(yīng)”。CME慢性期心室重構(gòu)無法單純用微小的梗死面積來解釋，與梗塞區(qū)相比更為突出的非梗塞區(qū)炎癥可能具有尤其重要的意義[7]。如何減輕CME伴發(fā)炎癥反應(yīng)及改善遠(yuǎn)期心室重構(gòu)是我們關(guān)心的問題。ARMYDA系列研究證實(shí)，阿托伐他汀可顯著降低血管成形術(shù)后心肌梗死，推測(cè)其可能通過抗炎機(jī)制發(fā)揮降低微栓塞、保護(hù)血管內(nèi)皮等有益作用[8,9]。國內(nèi)不少研究也顯示阿托伐他汀可降低hs-CRP，間接證實(shí)存在抗炎作用保護(hù)心血管[10]。我們?cè)谘芯恐杏^察了阿托伐他汀對(duì)CME后心肌炎癥反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，阿托伐他汀能顯著抑制微梗灶內(nèi)殘留的和周邊區(qū)缺血的心肌細(xì)胞、部分“正?！毙募〖?xì)胞，以及血管內(nèi)皮 TNF-α、IL-6、ICAM-1等炎癥因子的過度產(chǎn)生，減少心肌中炎性細(xì)胞聚集，發(fā)揮抗炎作用，進(jìn)一步減少心肌損害及遠(yuǎn)期心室重構(gòu)。

阿托伐他汀對(duì)冠狀動(dòng)脈微栓塞后心肌炎癥的影響

圖1 Atrovastatin對(duì)CME后TNF-α、IL-6、ICAM-1在心肌組織表達(dá)的影響（×200）

圖2 免疫組化染色Atrovastatin對(duì)CME后IL-6在心肌組織表達(dá)的影響（×200）

圖3 免疫組化染色Atrovastatin對(duì)CME后ICAM-1在心肌組織表達(dá)的影響（×200）

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Roles of atrovastatin in the myocardial inflammation following coronary microembolization

LI Shu-mei＊，HUANG Zhang-min，CHEN Liang-long.＊Department of Cardiology，the 476th Clinical Department of Fuzhou General Hospital，F(xiàn)uzhou 350002，China

LI Shu-mei，E-mail：zdoctor@sohu.com

ObjectiveTo investigate the roles of atrovastatin in the myocardial inflammation following coronary microembolization.MethodsCME model in 48 rats was created by injection homologous microthrombotic particle suspension into left ventricle when clamping the ascending aorta.The CME rats were randomized to untreated group and atrovastatin treated group （n=24 respectively）.The rats were sacrificed on day 7 post-operationally.The morphological characteristics were evaluated in sections with HE staining and the protein expressions of TNF-α，IL-6 and ICAM-1 were semi-quantitatively analyzed by immunohistochemistry and Western blot.ResultsAtrovastatin slightly reduced infarct size and significantly suppressed inflammatory cell infiltration and the protein expression of TNF-α，IL-6 and ICAM-1（P＜0.05）.ConclusionAtrovastatin markedly suppressed the TNF-α，IL-6 protein expression and effectively ameliorated myocardial inflammation.

Coronary microembolization； TNF-α； IL-6； ICAM-1； Statins

南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新基金（項(xiàng)目編號(hào)：09MA104）

350002 福建省福州市，南京軍區(qū)福州總院476醫(yī)院心內(nèi)科（李淑梅、黃章敏）；福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院心血管內(nèi)科（陳良龍）

李淑梅，E-mail：zdoctor@sohu.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2014．01．018

Q95-33；R543.3

A

1672-5301(2014)01-0056－03

2013-04-09）