郭艷萍，劉美林，賀東亮，趙金安

(太原工業(yè)學(xué)院 環(huán)境與安全工程系，山西 太原 030008)

抑制劑對黑雞心葡萄多酚氧化酶活性的影響

郭艷萍，劉美林，賀東亮，趙金安

(太原工業(yè)學(xué)院 環(huán)境與安全工程系，山西 太原 030008)

研究了不同濃度梯度的亞硫酸氫鈉、檸檬酸、EDTA、抗壞血酸4種抑制劑對清徐黑雞心葡萄多酚氧化酶(PPO)活性的抑制效果，旨在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗進一步優(yōu)化黑雞心葡萄在貯藏、運輸過程中防褐變添加劑的配方。結(jié)果表明：檸檬酸、EDTA、抗壞血酸對PPO活性表現(xiàn)出較好的抑制效果，3種抑制劑聯(lián)合作用的最佳組合為A1B2C2，即檸檬酸0.04 mmol·L-1，EDTA0.08 mmol·L-1，抗壞血酸0.08 mmol·L-1。PPO 活性的抑制率達到85.67%。

清徐黑雞心葡萄；多酚氧化酶；活性；抑制劑

黑雞心葡萄是山西清徐特有的葡萄品種，果穗大，果粒密實，形似雞心，色澤黑紫。果肉呈淡綠色且柔軟多汁，含糖量17%左右，含酸量1.5%左右，果實可以生食、制汁、制醬、制果醋。在黑雞心葡萄加工、貯運過程中，酶促褐變是主要的難題之一。酶促褐變的發(fā)生由多酚氧化酶(PPO)、過氧化氫酶等引起，其中發(fā)揮主要作用的是多酚氧化酶。

多酚氧化酶屬嚴格的質(zhì)體酶，由核基因編碼，多基因調(diào)控，參與生物氧化，是一種含Cu2+的末端氧化酶。在PPO的作用下組織中的酚類物質(zhì)被氧化成醌類物質(zhì)，醌可在無酶參與的條件下被氧化或者自身聚合形成黑色素。目前，研究抑制酶促褐變的方法主要有加熱、高壓、CO2冷處理、磁場作用、添加PPO酶活抑制劑等[1～3]，其中最經(jīng)濟最有效的方法當數(shù)添加PPO酶活抑制劑。已有學(xué)者研究不同抑制劑在果蔬保鮮中的作用[4]，但由于清徐黑雞心葡萄為地方特有品種，鮮見有關(guān)黑雞心葡萄中PPO的研究報道，因此，本文旨在研究不同抑制劑對清徐黑雞心葡萄PPO活力的影響，通過正交試驗篩選出最佳復(fù)合抑制劑組合，為黑雞心葡萄的加工、運輸及貯藏及控制酶促褐變提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清徐黑雞心葡萄(取自清徐縣徐溝鎮(zhèn)果園)；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、鄰苯二酚、亞硫酸氫鈉、EDTA-Na2、檸檬酸、抗壞血酸均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平、Thermo數(shù)顯pH儀、紫外可見分光光度計、TGL-16G-C高速冷凍離心機、電熱恒溫水浴鍋。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑雞心葡萄PPO酶液的制備[5]

稱取100 g洗凈晾干的黑雞心葡萄，加入4℃ pH6.8 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液300 mL，快速勻漿，在4℃，4000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液即為PPO粗酶液,放置于4℃冷藏保存。

1.3.2 黑雞心葡萄PPO酶活性的測定[6]

取磷酸緩沖液3.5 mL、0.1 mol·L-1的鄰苯二酚溶液1 mL和PPO 粗酶液0.5 mL，搖勻，30℃恒溫水浴15 min。在300～600 nm波長范圍進行波普掃描，確定PPO 粗酶作用產(chǎn)物的最大吸收波長(λmax=430nm)并計算PPO活力。加入PPO酶液開始計時，每隔20 s測定一次λmax處的光吸收值，測定3 min，以每分鐘樣品吸光度值增加0.001為1個酶活力單位(U)。

1.3.3 不同抑制劑對黑雞心葡萄PPO酶活性的抑制

以0.01 mol·L-1磷酸緩沖液6 mL、PPO酶液1mL、0.1 mol·L-1鄰苯二酚2 mL為反應(yīng)體系，分別加入不同濃度梯度(0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10 mmol·L-1)亞硫酸氫鈉、EDTA、檸檬酸、抗壞血酸1 mL為抑制劑，計算不同抑制劑對PPO活性的抑制率, 分析不同濃度抑制劑與黑雞心葡萄PPO活性的抑制關(guān)系。各種抑制劑取3組平行樣本，做2次重復(fù)試驗。

1.3.4 正交試驗篩選最佳復(fù)合抑制劑組合

在1.3.3單因素分析結(jié)果組間顯著性差異用t檢驗，在此基礎(chǔ)上，以抑制劑為因素，3組抑制濃度為水平做正交試驗，考察抑制劑聯(lián)合抑制效果，最終確定最佳復(fù)合抑制劑組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度亞硫酸氫鈉對黑雞心葡萄PPO活性的影響

研究表明亞硫酸氫鈉對酶的抑制作用主要體現(xiàn)于SO2對酶有直接抑制作用，同時它具有還原作用，可將中間產(chǎn)物鄰苯二醌不可逆地還原為無色物質(zhì)；另外，其還可與羰基加成，防止了羰基化合物的進一步聚合[7]。不同濃度亞硫酸氫鈉對黑雞心葡萄PPO活性的影響見圖1。從圖中可看出隨著亞硫酸氫鈉濃度的增加，其對酶活性的抑制率也逐步增加，濃度達到0.08 mmol·L-1時抑制率達到最大值30%，且較其余濃度的抑制效率均有統(tǒng)計學(xué)差異。濃度超過0.08 mmol·L-1時抑制率下降，對酶活力的抑制作用下降。

圖1 亞硫酸氫鈉對黑雞心PPO活性的影響

2.2 不同濃度檸檬酸對黑雞心葡萄PPO活性的影響

檸檬酸對PPO的抑制作用體現(xiàn)在一方面提供酸性環(huán)境使PPO偏離其最適pH，另一方面檸檬酸分子中所含的3個羧基能與酶分子中的銅離子發(fā)生鰲合，從而使酶失活[7]。不同濃度檸檬酸對黑雞心葡萄PPO活性的影響見圖2。當檸檬酸濃度在0.01～0.06 mmol·L-1范圍內(nèi)，隨著抑制劑濃度的增加，酶活性降低較快，檸檬酸濃度超過0.06 mmol·L-1后，酶活性降低速率放緩，0.08 mmol·L-1酶活性抑制率為72%，達到最大值，且較其余濃度的抑制效率均有統(tǒng)計學(xué)差異。抑制劑濃度繼續(xù)增大，抑制率稍有降低，但變化不大。

2.3 不同濃度EDTA對黑雞心葡萄PPO活性的影響

EDTA可與PPO中銅離子發(fā)生配位反應(yīng)從而抑制酶活性[4～7]。不同濃度EDTA對黑雞心葡萄PPO活性的影響見圖3。當EDTA濃度為0.01～0.06 mmol·L-1時，對酶活力的抑制率呈上升增長趨勢，當濃度為0.08 mol·L-1時，酶活力抑制率出現(xiàn)最大值77.6%，且較其余濃度的抑制效率均有統(tǒng)計學(xué)差異。超過0.08 mmol·L-1時 ，其對酶活力的抑制率反而降低。各組平行試驗均呈顯著性差異。

圖2 檸檬酸對黑雞心PPO活性的影響

圖3 EDTA對黑雞心PPO活性的影響

2.4 不同濃度抗壞血酸對黑雞心葡萄PPO活性的影響

抗壞血酸對PPO反應(yīng)體系有多重作用，它既可將O-醌還原成O-二羥基酚，又可螯合Cu2+，甚至可以被PPO直接氧化，體現(xiàn)出競爭性抑制[7,8]。由圖4可見，不同濃度抗壞血酸對黑雞心葡萄PPO活性的影響見圖4。當抗壞血酸濃度由0.01 mmol·L-1上升至 0.08 mmol·L-1時，PPO酶活被顯著抑制，抑制率由15%大幅增長至74%。隨著抑制劑濃度增加，抑制率并未增加反而略有降低。不同濃度的各組平行試驗均呈現(xiàn)出顯著性差異。

2.5 復(fù)合抑制劑對黑雞心葡萄PPO活性的影響

單一抑制劑的抑制實驗結(jié)果表明，亞硫酸氫鈉、EDTA、檸檬酸、抗壞血酸、對黑雞心葡萄PPO均有一定的抑制作用，其中檸檬酸、EDTA與抗壞血酸的抑制效果較好，亞硫酸氫鈉的抑制率較低。因此，采用L9(33)正交試驗(表1)分析由它們組成的復(fù)合抑制劑對PPO活性的聯(lián)合抑制效果。結(jié)果見表2。

圖4 抗壞血酸對黑雞心PPO活性的影響

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗表

由表2可見，根據(jù)極差分析，三因素中對黑雞心PPO活性的抑制作用：抗壞血酸gt;EDTAgt;檸檬酸，通過正交實驗得出的復(fù)合抑制劑優(yōu)化組合：A1B2C2，即檸檬酸0.04 mmol·L-1，EDTA0.08 mmol·L-1，抗壞血酸0.08 mmol·L-1。在此條件下測得復(fù)合抑制劑對黑雞心多酚氧化酶的抑制效果最佳，抑制率達到85.67%。

3 討論

隨著多酚氧化酶研究的不斷深入，它的作用機理逐漸明確、應(yīng)用范圍逐步擴大。多酚氧化酶是引起果蔬褐變的主要原因，它促使酚類物質(zhì)氧化生成黑色素，嚴重影響了果蔬的營養(yǎng)、風(fēng)味和外觀品質(zhì)。[8,9]

目前，常用的防止酚類物質(zhì)褐變的方法主要有兩種：一是用EDTA等酚類物質(zhì)的螯合劑，或乙醇、丙酮等有機溶劑將酚溶解[4～6]，通過離心而將酚類物質(zhì)除去；二是向提取液中加入VC等抗氧化劑[10]。

本文采用了亞硫酸氫鈉、抗壞血酸、EDTA和檸檬酸四種單一抑制劑對研究清徐黑雞心葡萄的多酚氧化酶活性。結(jié)果顯示亞硫酸氫鈉抑制效果較差，與龐凌云等[11]的報道有所差異，究其原因可能是黑雞心葡萄自身的酸度較大，抑制了亞硫酸氫鈉水解產(chǎn)生SO2，降低了其對PPO的抑制作用。本研究中抗壞血酸呈現(xiàn)出對PPO活性較強的抑制作用，另一方面其又是食品營養(yǎng)強化劑[12]，在降低褐變的同時又補充了人們所需的營養(yǎng)物質(zhì)，因此，以抗壞血酸為主要成分的PPO復(fù)合抑制劑在果蔬保鮮上有廣泛的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

4種抑制劑中EDTA對清徐黑雞心葡萄多酚氧化酶活性效果最好(添加0.08 mmol·L-1濃度的EDTA抑制率高達77.60%)，抗壞血酸、檸檬酸的抑制效果次之，亞硫酸氫鈉的抑制效果較差。

對清徐黑雞心葡萄多酚氧化酶活性的抑制作用：抗壞血酸gt;EDTAgt;檸檬酸，通過正交實驗得出的復(fù)合抑制劑優(yōu)化組合：A1B2C2，即檸檬酸0.04 mmol·L-1，EDTA0.08 mmol·L-1，抗壞血酸0.08 mmol·L-1，抑制率達到85.67%。

[1]王宏延,曾凱芳,賈凝,等.不同質(zhì)量濃度臭氧化水對鮮切西蘭花貯藏品質(zhì)的影響[J].食品科學(xué),2012,33(2):267-270．

[2]徐芹,喬勇進,方強，等.碭山酥梨多酚氧化酶酶學(xué)特性及抑制效應(yīng)的研究[J].食品科學(xué),2008,29(4):74-77．

[3]Rapeanu G, Van Loey A, Smout C, et al. Biochemical characterization and process stability of polyphenoloxidase extracted from Victoria grape (Vitis vinifera ssp Sativa) [J]. Food Chemistry, 2006, 94(2): 53-61.

[4]李佩艷,侯玉澤,李松彪，等.澳洲青蘋多酚氧化酶特性的研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2006 (9):93-96.

[5]魯吉珂,牛夏南，王曉東，等.植物源多酚氧化酶篩選及其活性抑制探究[J].食品與發(fā)酵科技,2013,49(2):30-33.

[6]熊何健，盧玉蘭. 荔枝殼中多酚氧化酶活性研究[J].食品科學(xué), 2006,27(12):183-185.

[7]張莉, 陳乃富. 多酚氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)及其應(yīng)用研究[J].安徽農(nóng)業(yè)學(xué)報,2006,12(12): 29-30.

[8]趙麗華.不同抑制劑對石榴多酚氧化酶的影響[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(2):58-60.

[9]任順成,張丹,喬青青.小麥中多酚氧化酶抑制劑的篩選及應(yīng)用[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2013,34(1):1-6.

[10]史焱,詹先成,呂太平，等.抗氧劑亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉及焦亞硫酸鈉氧化反應(yīng)速率常數(shù)的測定[J].化學(xué)學(xué)報,2006,64(6):496-500.

[11]龐凌云,祝美云,詹麗娟,等.菜花多酚氧化酶的酶學(xué)特性研究[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2013，47(1):83-87.

[12]羅志剛,楊連生,姜紹通，等.抗壞血酸和亞硫酸鈉在甘薯破碎中抗褐變的研究[J].食品工業(yè)科技, 2002(5): 52-53.

TheInfluencesofDifferentInhibitorsonPolyphenolOxidaseActivityinBlackHeartGrapes

Guo Yanping, Liu Meilin, He Dongliang, Zhao Jinan

(DepartmentofEnvironmentalandSafetyEngineering,TaiyuanInstituteofTechnology,TaiyuanShanxi030008,China)

The effects of inhibitors including sodium hydrogen sulfite, citric acid, EDTA and ascorbic on polyphenol oxidase activity (PPO) in heart-shaped Qinxu black grapes were investigated. Based on the results of single factor experiment, orthogonal experiment was applied to optimize the formula of anti-browning additive for the storage and transportation of black heart-shaped grape . Results indicated that citric acid, EDTA and ascorbic acid showed better inhibition effect on PPO activity, the best combination for inhibition was A1B2C2, namely citric acid tendency for 0.04 mmol·L-1, EDTA 0.08 mmol·L-1tendency, L ascorbic acid tendency for 0.08 mmol·L-1, with PPO activity inhibition rate up to 85.67%.

Black grapes; Polyphenol oxidase; Activity; Inhibitors

2014-05-13

2014-06-18

郭艷萍(1984-)，女(漢)，山西太原人，碩士，研究方向：植物蛋白質(zhì)工程。

山西省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目；太原工業(yè)學(xué)院青年科學(xué)基金資助項目(2013LQ01)。

TS201.3

A

1671-8151(2014)05-0477-04

(編輯：馬榮博)