毛春玲 陳欣 王靜 秦立鑫/哈藥集團生物疫苗有限公司

豬支原體肺炎雙抗體夾心ELISA方法的建立

毛春玲 陳欣 王靜 秦立鑫/哈藥集團生物疫苗有限公司

豬肺炎支原體（MPS）是由豬支原體肺炎（Mhp）引起的豬地方流行性肺炎，該病是一種接觸性慢性呼吸道傳染病。豬只感染后會降低飼料轉(zhuǎn)化率，影響生長發(fā)育，并引起其他病毒及細菌的繼發(fā)感染。該病流行于世界各地，對養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。（1）由豬肺炎支原體所引起的豬氣喘病普遍存在于養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達的國家，該病一直以來是困擾我國養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要疾病。據(jù)統(tǒng)計，2010年我國生豬出欄近6億頭，90%以上養(yǎng)殖基地和規(guī)?；B(yǎng)豬場都存在著感染豬肺炎支原體的風險，國內(nèi)該病的感染率可高達80%，是造成我國養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟損失的豬重要傳染病之一。

由于本病同其他引起豬呼吸道的疾病表現(xiàn)出極為相似的臨床癥狀, 并可與豬藍耳病病毒（Prrs）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）,胸膜肺炎放線桿菌（APP）等混合感染，并伴隨混合感染和繼發(fā)感染, 增加了臨床診斷的難度。目前MhPs的診斷方法主要有：病原分離培養(yǎng)，間接血凝抑制（IHA）、補體結合試驗（CFT）、 PCR、環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP）等方法(4）。病毒分離耗時長：PCR、IHA、CFT、LAMP等方法對操作條件及人員有很高的要求，并且費用較高，均不適合在現(xiàn)地推廣。

針對現(xiàn)地中檢測Mhp的情況，我們開展了建立雙抗體夾心ELISA檢測Mhp的研究，以抗Mhp的兔多抗為捕獲抗體，抗MhPs的單克隆抗體3D6為檢測抗體，建立了具備較好的敏感性、特異性及重復性的雙抗體夾心ELISA方法。

一、材料與實驗方法

1.抗體制備?？筂hp的單抗3D6及抗Mhp的兔多抗由哈藥集團生物疫苗有限公司保存。

將保存的單抗3D6及抗Mhp的兔多抗分別用GE公司的ProteinG 和ProteinA試劑盒進行抗體純化，并用BCA Protein Assay kit對抗體濃度進行測定。按照測定結果，將單抗3D6用PBS的濃度調(diào)節(jié)為3ug/ml,用pH9.6的碳酸鹽溶液調(diào)節(jié)抗MhPS的兔多抗的濃度為5ug/ml。

2.雙抗體夾心ELISA實驗方法。

（1）將用pH9.6的碳酸鹽溶液稀釋后的抗MhP兔多抗包被，每孔加入100μl, 置4℃過夜，棄去孔中液體。

（2）含0.5%Tween-20的PBS溶液洗板3次，每次3 min。

（3）加入待檢測樣品和不含病毒的空白對照，37℃孵育1h。

（4）棄去孔中液體 ，用含0.5%Tween-20的PBS溶液洗板3次，每次3 min。

（5）加入調(diào)節(jié)好濃度的抗PRRSV的N蛋白的單抗3D6加入孔中，3 ug/ml，每孔100 ul，37℃孵育1 h。

（6）棄去孔中液體，用含0.5%Tween-20的PBS溶液洗板3次，每次3 min。

(7） 加入酶標抗鼠抗體，37℃孵育40 min。

（8）棄去孔中液體 ，用含0.5%Tween-20的PBS溶液洗板3次，每次3 min。

（9）加入TMB(四甲基聯(lián)苯胺）顯色液，每孔100 ul，置37℃避光放置15 min。最后加入2 mol/l的H2SO4終止反應，測定OD450值。

四、結果判斷

根據(jù)對30份Mhp陰性血清的結果，其均值為0.098，標準差為0.014，得到其陰陽界限值為0.14，因此取OD450≥0.2作為陽性的判定標準。

五、PCR檢測方法

1.DNA提取。（1）取200mg待測樣品，放到1.5ml EP管中。（2）將待測樣品12 000rpm離心2 min。（3）沉淀物加入567 ul的TE緩沖液，反復吹打使之重新懸浮，加入30 ul 10%SDS和15 ul的蛋白酶K，混勻，于37℃溫育1 h。（4）加入100 ul 5 mol/L NaCl, 充分混勻，再加入80 ul CTAB/NaCl溶液，混勻后再65℃溫育10 min。（5）加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，離心4～5 min, 將上清轉(zhuǎn)入一只新管中，加入0.6～0.8倍體積的異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來，沉淀可稍加離心。（6）沉淀用1 ml的70%乙醇洗滌后，離心棄乙醇。

Mhps的稀釋梯度106 105 104 103 102 101 100 PCR +++++－ －ELISA +++++－ －

2.PCR。（1）25ul的反應體系，冰上操作，稍后短時間離心。Template 1ul/3ul、Primer 1 1ul、Primer 2 1ul、2×Master 12.5ul、ddH2O 補至 25ul (9.5ul/7.5ul）。

Primer 1序列為 5’-CCCCCATCCATGAAACC TATTAAAATACCTCTAATTCCT-3’

Primer 2序列為 5’-CCCAAGCTTTTTAAATA TTTTTAATTGCATCTGATAAAT-3’

（2）PCR循環(huán): ①95℃ 5 min、②94℃ 30 s、③53℃ 60 s、④72℃ 60 s(從第2步開始循環(huán)30～35個循環(huán)）、⑤ 72℃ 7 min、⑥ 4℃

PCR結束后-20℃保存或置于冰上開始電泳，目的片段大小為948 bp。

五、實驗方法評價

1.敏感性試驗。將CCU檢測為1*107.0的Mhp的陽性樣品進行梯度稀釋，檢出的最低濃度定為該方法的靈敏度。

2.重復性及特異性試驗。應用該方法對20份陽性病料及10份陰性病料及5份Mhp菌液培養(yǎng)物進行重復，每次間隔時間為一周，共進行6次重復，結果均無差異，說明該方法具有良好的重復性。

應用該方法對豬的其他病毒病及細菌病進行了特異性檢測，該方法對副豬嗜血桿菌桿菌、豬圓環(huán)病毒、豬細小病毒、豬胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉及豬瘟的檢測均為陰性，證明該方法具有良好的特異性。

3.樣品檢測結果。應用本研究建立的雙抗體夾心ELISA方法，檢測采集自黑龍江、吉林省5個大中型豬場豬只的鼻拭子、組織臟器、全血樣品共計128份。并和PCR方法進行了比較，敏感性略低于PCR方法。

陽性 陰性 總計 檢出率PCR 42 86 128 32.81%ELISA 41 87 128 32.03%

六、討論

豬支原體肺炎在世界范圍內(nèi)廣泛流行，并且發(fā)病率高，一旦暴發(fā)就很難控制。雖然目前在對Mhp的研究工作有了很大的進展，但是仍有很多方面工作需要進一步改進。本研究針對目前現(xiàn)地檢測的方法進行了相關實驗的研究。通過敏感性、特異性及重復性實驗結果可以看出，本實驗方法具有很好的敏感性、特異性及重復性。并且在利用該方法對現(xiàn)地樣品進行檢測，方法簡便，具有較好的敏感性和重復性，且無交叉反應。方法制備簡單，成本低，對現(xiàn)地人員的操作要求較低，適合在現(xiàn)地進行推廣。

（略）