喻佰啟，王永祿，殷海翔，王棟，呂貝貝，李學(xué)明

（1.南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 211816；2.馬鞍山市臨床檢驗(yàn)中心，安徽 馬鞍山 243000）

響應(yīng)面法優(yōu)化鹽酸多西環(huán)素緩釋片處方工藝

喻佰啟1，2，王永祿1Δ，殷海翔1，王棟1，呂貝貝1，李學(xué)明1

（1.南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 211816；2.馬鞍山市臨床檢驗(yàn)中心，安徽 馬鞍山 243000）

目的利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化鹽酸多西環(huán)素緩釋片處方。方法通過單因素考察確定對釋放度影響最大的3個因素：羥丙基甲基纖維素（hydroxypropylmethyl cellulose，HPMC）的用量、粘合劑聚乙烯吡咯烷酮-K30（polyvinylpyrrolidone-K30，PVPK30）的濃度、乳糖與微晶纖維素（microcrystalline cellulose，MCC）的比例，以2 h、4 h、8 h的釋放度綜合評分作為響應(yīng)值，利用Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法，確定各處方的用量。結(jié)果篩選得到優(yōu)化的處方為：HPMC K15質(zhì)量分?jǐn)?shù)為片重的30%、粘合劑PVP-K30濃度為10%、乳糖與MCC比例為1∶3，其體外釋藥行為較理想。結(jié)論篩選所得的鹽酸多西環(huán)素緩釋片處方工藝穩(wěn)定可行。

鹽酸多西環(huán)素；緩釋片；響應(yīng)面法；體外釋放度

目前臨床治療干眼癥使用的多西環(huán)素制劑主要為普通片／膠囊以及腸溶片／膠囊。多西環(huán)素普通片／膠囊劑的缺點(diǎn)在于血藥濃度波動較大，有效血藥濃度的維持時間較短，常需要重復(fù)多次給藥才能達(dá)到治療效果，從而增加了治療成本。多西環(huán)素腸溶膠囊雖能減輕刺激性，但多西環(huán)素的最佳吸收部位是胃及小腸上段，腸溶膠囊會降低其生物利用度。為減少患者服藥次數(shù)，提高其順應(yīng)性，本研究以HPMC作為凝膠骨架材料，采用Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計法優(yōu)選了鹽酸多西環(huán)素緩釋片的處方，研制出日服1次即可保證有效血藥濃度和治療效果的鹽酸多西環(huán)素的口服緩釋片。

1 材料與方法

1.1 儀器 ZRS-8G智能溶出試驗(yàn)儀（天津大學(xué)無線電廠）；BP211D電子天平（德國賽多利斯公司）；HGC-24A型24孔干式加熱氮吹儀（北京萬誠博達(dá)科貿(mào)有限公司）；TG16-W微量高速離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；TU-1901雙光束紫外分光光度儀（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；DP3U單沖壓片機(jī)（天津國藥龍立科技有限公司）

1.2 試藥 鹽酸多西環(huán)素原料藥（河南中帥醫(yī)藥有限公司，批號：D20110321）；鹽酸多西環(huán)素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：0485-9901）；鹽酸多西環(huán)素緩釋片（南京工業(yè)大學(xué)藥劑研究室自制，批號：20130928，規(guī)格：每片40 mg）；羥丙甲基纖維素（Hydroxypropyl Methyl Cellulose，HPMC，上?？房蛋录夹g(shù)有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮-K30（Polyvinylpyrrolidone-K30，PVP-K30），乳糖，微晶纖維素均為上海運(yùn)宏化工制劑輔料技術(shù)有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 釋放度測定方法的建立

1.3.1 檢測波長的選擇 取鹽酸多西環(huán)素適量，用純水作為溶出介質(zhì)溶解，配成適宜濃度的待測溶液。照紫外分光光度法（中國藥典2010年版二部附錄IV A）［5］，在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。分別稱取處方量輔料，加水稀釋溶解成適宜濃度的待測溶液，用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，以確定鹽酸多西環(huán)素釋放介質(zhì)中的最大吸收波長。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取鹽酸多西環(huán)素對照品10 mg，精密稱定，置200 mL量瓶中，加水溶解并稀釋制得濃度為50.0μg／mL的對照品儲備液。分別精密吸取該儲備液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL置于 10mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，定容，制得濃度為 5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0μg／mL的對照品溶液，水溶液為空白對照，照紫外分光光度法（中國藥典2010年版二部附錄IV A）［5］，在波長275 nm處分別測定其吸收度A，將吸收度（A）與樣品濃度（C）進(jìn)行線性回歸。

1.3.3 精密度試驗(yàn) 取1.3.2項下制備的濃度為5.0、12.5、20.0μg／mL的供試品溶液，照紫外分光光度法測定吸收度A，在同一天內(nèi)每隔2 h測定1次，一日內(nèi)連續(xù)測定5次，計算日內(nèi)精密度；以及每天測定1次，連續(xù)5 d測定，計算日間精密度。

1.3.4 回收率試驗(yàn) 照標(biāo)準(zhǔn)曲線下濃度配制方法，按照處方量加入各輔料，加0.01mol／L鹽酸溶液配制成低、中、高濃度分別為5.0、12.5、20.0μg／mL的鹽酸多西環(huán)素對照品溶液，在275 nm處測定吸收度A，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出鹽酸多西環(huán)素含量，以測定濃度與配制濃度之比計算回收率。

1.4 鹽酸多西環(huán)素緩釋片的制備與處方篩選 稱取處方量鹽酸多西環(huán)素（40mg／片）和羥丙甲纖維素（HPMC，K15M）、乳糖、微晶纖維素，過100目篩，充分混勻，再加入粘合劑PVP-K30無水乙醇溶液制備濕軟材，過24目篩制顆粒，于50℃干燥2 h，過24目篩整粒，最后加入硬脂酸鎂充分混勻，壓片。分別考察制劑處方中主要影響因素（HPMC的用量、粘合劑PVP-K30的濃度、乳糖與MCC的比例）對處方溶出度的影響，再根據(jù)單因素考察結(jié)果，采用響應(yīng)面對鹽酸多西環(huán)素緩釋片的處方作進(jìn)一步篩選以確定最佳處方。

2 結(jié)果

2.1 釋放度測定方法的建立

2.1.1 檢測波長的選擇 結(jié)果顯示：鹽酸多西環(huán)素在275 nm波長處有最強(qiáng)吸收峰，在203 nm和345 nm處有次強(qiáng)吸收峰；輔料在上述各波長條件下無吸收，不干擾主藥?？紤]到203 nm處屬于末端吸收，345 nm處靈敏度較275 nm處差，因此選擇275 nm作為鹽酸多西環(huán)素的檢測波長。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 結(jié)果得到回歸方程為A＝0.0409C＋0.0221，r＝0.999 4（n＝7），結(jié)果表明鹽酸多西環(huán)素紫外吸收值與濃度在5.0～20.0μg／mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.1.3 精密度試驗(yàn) 結(jié)果，日內(nèi)和日間精密度的RSD均小于2%，表明本方法精密度良好，穩(wěn)定可靠。

2.1.4 回收率試驗(yàn) 結(jié)果低、中、高3個濃度的回收率分別為100.1%、100.8%、99.8%，表明樣品分析的回收率良好，片劑中的輔料不影響主藥的測定。

2.2 單因素篩選處方

2.2.1 HPMC用量的影響 按處方分別加入片重的20%、30%、40%的HPMC作為骨架材料，保持含藥量和片重不變，不足質(zhì)量用稀釋劑乳糖和微晶纖維素補(bǔ)足，按“1.4”項下方法壓片，測定其釋藥速度，考察HPMC用量對藥物釋放的影響（見圖1）。

圖1 HPMC用量對片劑釋放的影響Fig.1 The effect of different dosage of HPMC on the drug release

當(dāng)HPMC用量為20%時，藥物迅速釋放，其主要原因是HPMC用量較小，導(dǎo)致其不能在片劑表面快速形成連續(xù)凝膠骨架層，導(dǎo)致片子快速崩解，釋放加快。當(dāng)HPMC用量增加到30%和40%時，則能起到穩(wěn)定的緩釋效果。

2.2.2 粘合劑濃度的影響 本研究分別以5%、10%、15%濃度的PVP-K30無水乙醇溶液制備片芯，考察粘合劑濃度對藥物釋放的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 粘合劑濃度對片劑釋放的影響Fig.2 The effect of different concentration of PVP-K30 on the drug release

片劑制備濕法制粒過程中，粘合劑用以增加藥物微粒間的粘合作用，粘合劑的濃度也是影響藥物溶出的一個重要因素。由圖2可知粘度過高可能導(dǎo)致藥物釋放時釋放減慢，粘度過低則易導(dǎo)致藥物釋放加快。隨著HPMC的用量的增大，片劑的釋放速度逐漸變慢。

2.2.3 乳糖和微晶纖維素用量的影響 本實(shí)驗(yàn)考察了乳糖和微晶纖維素的不同用量（乳糖∶微晶纖維素＝4∶0、2∶2、1∶3、0∶4）對藥物各時段的釋放度的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 乳糖和微晶纖維素用量對片劑釋放的影響Fig.3 The effect of the ratio of lactose tomicrocrystalline cellulose on the drug release

結(jié)果可見，乳糖能夠起到促進(jìn)藥物釋放的作用，其主要原因是乳糖在片劑中可以起到致孔劑的作用，從而加大凝膠骨架的空隙，同時減少了藥物的擴(kuò)散阻力。而當(dāng)乳糖與微晶纖維素2者以適當(dāng)比例聯(lián)用時，則可達(dá)到較為滿意的緩釋效果。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)選處方工藝

2.3.1 模型的建立 本研究選擇骨架材料HPMC的用量（A）、粘合劑PVPK30的濃度（B）、乳糖與微晶纖維素的比例（C）作為考察對象，上述3個因素分別選擇3個水平，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)原理設(shè)計實(shí)驗(yàn)［6］，按照1.4項下方法制備鹽酸多西環(huán)素緩釋片，以2 h、4 h、8 h的累積溶出度作為評價指標(biāo)對處方進(jìn)行優(yōu)化，因素水平見表1。為準(zhǔn)確并詳細(xì)反映各因素的不同水平對藥物釋放行為的影響，本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)采用綜合評分法，對處方2、4、8 h的釋放度結(jié)果進(jìn)行評分，將評分結(jié)果進(jìn)行加權(quán)相加后得出總分，并結(jié)合響應(yīng)面分析法進(jìn)行分析［6-7］。評價指標(biāo)如下：a，藥物2 h的累積釋放度F2；b，藥物4 h的累積釋放度F4；c，藥物8 h的累積釋放度F8。其中2、4、8 h的理想累積釋放百分率分別擬定為40%、60%、90%，將各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)定為1，得計算公式：L＝其中，L值越小，結(jié)果越佳［6-9］。同時考察片劑的外觀，優(yōu)選處方。試驗(yàn)設(shè)計見表2。

表1 因素水平表Tab.1 Factors and levels

表2 Box-Behnken設(shè)計及結(jié)果Tab.2 Experimental runs and values of responses for Box-Behnken design

2.3.2 響應(yīng)面分析及最優(yōu)水平的確定 將表2中試驗(yàn)因素、水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果用design expert 8.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理［6］，以綜合評分法對HPMC的用量（A）、粘合劑用量（B）、乳糖與MCC比例（C）的各水平進(jìn)行多元線性擬合，通過手動簡化得到的擬合方程為：L＝5.66-3.25A-0.77B＋2.43C＋0.57AB-4.08AC＋2.64A2＋1.24C2，該方程相關(guān)系數(shù) R2＝0.943，修正系數(shù) Adj R2＝0.899，表明該模型實(shí)測值與方程預(yù)測值有相關(guān)性，失擬項（P＝0.1454）不顯著，說明該模型選擇合理，因此可以用回歸方程對鹽酸多西環(huán)素緩釋片處方進(jìn)行預(yù)測分析。根據(jù)回歸方程，運(yùn)用design expert 8.0統(tǒng)計軟件作出響應(yīng)面分析立體圖［6］，結(jié)果見圖4。

圖4 HPMC的用量（A）、粘合劑用量（B）、乳糖與MCC比例（C）對釋放度影響的響應(yīng)面圖Fig.4 The response surface plot of different factors（the amount of HPMC，the amount of adhesives and the ratio of lactose tomicrocrystalline cellulose）on the release

考慮到實(shí)際操作的便利性，同時結(jié)合響應(yīng)面模型分析最終確定鹽酸多西環(huán)素緩釋片的最佳處方工藝為：HPMC K15質(zhì)量分?jǐn)?shù)為片重的30%、粘合劑PVP-K30濃度為10%、乳糖與MCC比例為1∶3。

2.3.3 處方工藝的重現(xiàn)性 按優(yōu)化后的處方制備3批鹽酸多西環(huán)素緩釋片，分別測定其體外釋放度，下圖5為3批樣品的釋放曲線。結(jié)果表明：3批產(chǎn)品的溶出度均能夠達(dá)到設(shè)計要求。2 h時達(dá)到標(biāo)示量的35%～45%，4 h時達(dá)到標(biāo)示量的55%～65%，8 h時均大于標(biāo)示量的90%（見圖5）。

圖5 處方工藝重現(xiàn)性Fig.5 The reproducibility of doxycycline hydrochloride sustained release tablets of three batch

2.3.4 釋藥模型的擬合 本研究根據(jù)親水性凝膠骨架片的特點(diǎn)和可能的釋藥機(jī)理，分別采用零級釋放、一級釋放、Higuchi等模型對體外釋放數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合［10-13］（見表3）。

表3 鹽酸多西環(huán)素釋藥機(jī)制的模型Tab.3 Themodels for the release of doxycycline hydrochloride tablets

結(jié)果表明，以Higuchi方程擬合時，相關(guān)性系數(shù)最大，而半經(jīng)驗(yàn)方程（Ritger-Peppas）為 LnQ ＝0.6462Lnt＋3.2622（n＝0.6462，r＝0.9979）。當(dāng)方程系數(shù)大于0.45小于0.89時，藥物的釋放為非Fick擴(kuò)散的原理，即擴(kuò)散與溶蝕并存，故鹽酸多西環(huán)素的體外釋放行為是藥物擴(kuò)散與骨架溶蝕雙重機(jī)制［6，14-15］。

3 討論

HPMC在鹽酸多西環(huán)素緩釋片中含量是影響藥物釋放的主要因素，當(dāng)HPMC含量增加后，片劑水化速度加快，片劑表面可以迅速形成凝膠層，導(dǎo)致藥物釋放速度減慢，但當(dāng)HPMC用量超過一定限度時，其延緩藥物釋放的作用并不會增強(qiáng)［16］。本研究應(yīng)用響應(yīng)面法結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證優(yōu)化鹽酸多西環(huán)素的處方，對HPMC用量、粘合劑的用量以及乳糖與MCC的比例進(jìn)行了篩選，所得產(chǎn)品的釋放度符合預(yù)期要求，方法直觀、精密、預(yù)測性良好。

［1］Sobrin L，Liu Z，Monroy DC，etal.Regulation of stromelysin（MMP-3）activity in human tear fluid and corneal epithelial culture supernatant［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2000，41（7）：1703-1709.

［2］Abrabam S，Rosenblatt M，Li DQ，et al.Doxycydline inhibition of interleukin-1 in the corneal epithelium［J］.InvestOphthalmol Vis Sci，2000，41（9）：2344-2357.

［3］Dursun D，Kim MC，Solomon A，et al.Treatment of recalcitrant recurrent corneal erosionswith inhibitors ofmatrixmetalloproteinase-9，doxycycline and corticosteroids［J］.Am JOphthalmol，2001，132（1）：8-13.

［4］Zengin N，Tol H，Gunduz，et al.Meibomian gland dysfunction and tear film abnormalities in rosacea［J］.Cornea，1995，14（2）：144-146.

［5］國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）［S］.2010年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

［6］沈艷，任麗莉，王丞，等.響應(yīng)面法優(yōu)化富馬酸喹硫平緩釋片處方［J］.中國藥房，2012，23（33）：3108-3111.

［7］江東波，馬曉鸝，黃冬，等.鹽酸氯米帕明緩釋片的制備及其體外釋放度考察［J］.中國藥房，2009，20（13）：1005-1007.

［8］王珣，孫佩男，欒琳，等.別嘌醇緩釋片的制備及釋藥機(jī)理的初步探討［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2007，24（3）：138.

［9］龍明立，賀麗平，曾建國.復(fù)方阿侖膦酸鈉緩釋片的制備及體外釋放度考察［J］.中國藥房，2008，19（34）：2690.

［10］Dash S，Murthy P N，Nath L，et al.Kinetic modeling on drug release from controlled drug delivery systems［J］.Acta Pol Pharm，2010，67（3）：217-223.

［11］Zhao H Q，Jayasinghe D，Hossainy S，et al.A theoretical model to characterize the drug release behavior of drug-eluting stents with durable polymer matrix coating［J］.Journal of Biomedical Materials Research Part A，2012，100（1）：120-124.

［12］D’Angelo C，Zunino P，Porpora A，et al.Model reduction strategies enable computational analysis of controlled drug release from cardiovascular stents［J］.SIAM Journal on Applied Mathematics，2011，71（6）：2312-2333.

［13］Mailloux S，Halámek J，Katz E.A model system for targeted drug release triggered by biomolecular signals logically processed through enzyme logic networks［J］.Analyst，2014.

［14］GrassiM，Grassi G，Lapasin R，et al.Understanding drug release and absorption mechanisms：a physical and mathematical approach［M］.CRC Press，2010.

［15］梁文權(quán).生物藥劑學(xué)與藥物動力學(xué)［M］.第四版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：38.

［16］Siepmann J，Peppas N A.Modeling of drug release from delivery systems based on hydroxypropy methylcellulose（HPMC）［J］.Advanced drug delivery reviews，2001，48（2）：139-157.

（編校：吳茜）

Optim izing the preparation of doxycycline hydrochloride sustained release tablet using response surfacemethodology

YU Bai-qi1，2，WANG Yong-lu1Δ，YIN Hai-xiang1，WANG Dong1，LV Bei-bei1，LIXue-ming1

（1.School of Pharmaceutical Sciences，Nanjing University of Technology，Nanjing 211816，China；2.Clinical Laboratory Center of Ma’anshan，Ma’anshan 243000，China）

ObjectiveIn this article Response Surface Analysis（RSA）was applied to optimize the formulation of doxycycline hydrochloride sustained release tablet.MethodsSingle factor explorationwasused to determine the three factorswhich have the greatest impacton the release rate.The three factors were the dosage of the HPMC in the total weight of the tablet，the concentration of PVP-K30，and the ratio of lactose to microcrystalline cellulose，respectively.The composite score of the release behaviourwas taken as the response value.The dosage of the ingredientswere determined by Box-Benhnke design principles and 3 factors and 3 levels.ResultsThe optimized formulation and process are as follows：the dosage of the HPMC in the totalweight of the tabletwas 30%；the concentration of PVP-K30 was 10%，and the ratio of lactose tomicrocrystalline cellulose was 1∶3.The release behavior in vitro is ideal.ConclusionThe optimized preparation process of doxycycline hydrochloride sustained release tablet is stable，highly efficient and suitable for industrial production.

doxycycline hydrochloride；sustained-release tablets；response surfacemethodology；release in vitro

R943

A

1005－1678（2014）04－0165－04

多西環(huán)素是由土霉素經(jīng)6α-位上脫氧而得到的一種半合成四環(huán)素類抗生素，為廣譜抗菌劑，臨床上可用于立克次體、支原體、衣原體、革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌等多種微生物感染的治療與預(yù)防。角結(jié)膜干燥癥俗稱干眼癥，是由于眼淚的數(shù)量不足或者質(zhì)量差，導(dǎo)致的眼部干燥的綜合癥。絕大多數(shù)干眼都是由于結(jié)膜或淚腺的免疫性炎癥所致。基質(zhì)金屬蛋白酶及白細(xì)胞介素1在干眼癥的發(fā)病中具有重要作用，研究發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素對基質(zhì)金屬蛋白酶3、9［1］及白細(xì)胞介素 1［2］的活性有明顯的抑制作用，臨床試驗(yàn)證明多西環(huán)素對改善干眼癥有顯著的效果［3-4］。

江蘇省博士后科研資助計劃（1301012A）；江蘇政府留學(xué)獎學(xué)金（2013）；國家自然科學(xué)基金資助項目（81170492）

喻佰啟，女，碩士，主管檢驗(yàn)師，研究方向：藥物制劑，E-mail：1072802506＠qq.com；王永祿，通信作者，男，博士，副教授，研究方向：納米醫(yī)學(xué)，E-mail：wl_761107＠163.com。