杜 威，江 萍，王彥蘇，呂立新，王宏偉，卜元卿，劉常宏，戴傳超,*

(1. 南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 江蘇省微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心，江蘇省微生物與功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023； 2. 環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京 210042；3. 南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210093)

白僵菌是一種典型的殺昆蟲真菌，作為一種微生物農(nóng)藥在全世界廣泛使用[1]，白僵菌能夠寄生在多種昆蟲體內(nèi)并產(chǎn)孢[2]，它可以拮抗許多植物莖內(nèi)和葉際病原菌如灰霉病菌[3]、立枯絲核菌[4]等，除了能夠抑制病原菌菌絲生長(zhǎng)，還能誘導(dǎo)多種病原菌的細(xì)胞裂解[5]。目前已經(jīng)報(bào)道白僵菌可以成為很多植物的內(nèi)生菌，例如其在可可豆[6]、咖啡幼苗[7]、玉米[8]中共生，也有研究表明其可以在一些樹種如西部白松[9]、椰棗[10]等樹中共生。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于白僵菌的研究集中于其殺蟲機(jī)制以及與植物體的共生、拮抗病原菌等。對(duì)于其在土壤和葉際微生態(tài)系統(tǒng)中的行為研究較少，李永利等研究發(fā)現(xiàn)低溫、壤土及土壤含水量為15%的條件下有利于白僵菌的宿存[11]，王濱等研究了白僵菌在土壤中的宿存情況，發(fā)現(xiàn)前2個(gè)月內(nèi)處于波動(dòng)狀態(tài)，隨后下降較快，但在宿存過程中產(chǎn)孢量不受影響[12]。但是在葉際微生態(tài)系統(tǒng)中白僵菌的殘留以及其對(duì)葉際微生態(tài)系統(tǒng)和植物本身的生理水平影響的研究幾乎沒有。在植物葉際生存的微生物稱為葉際微生物[13]，對(duì)葉際微生物的研究遠(yuǎn)落后于根際微生物的研究[14]，而葉際微生物作為一類重要的群體具有固氮[15]，抵御病害[16]及改變宿主微環(huán)境等功能，對(duì)外界變化也較敏感，因此研究白僵菌施用后對(duì)植物葉際的微生物群落結(jié)構(gòu)、植物生理代謝水平影響及其在植物葉際的殘留動(dòng)態(tài)對(duì)于評(píng)價(jià)微生物農(nóng)藥白僵菌的生物安全性有重要意義。

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等3種抗氧化酶類能夠有效的反映植物的生理代謝水平變化，可作為評(píng)價(jià)外界環(huán)境條件變化對(duì)植物生理代謝影響的指標(biāo)。微生物群落結(jié)構(gòu)變化也可作為評(píng)價(jià)外界環(huán)境變化影響的指標(biāo)。目前，廣泛利用分子生物學(xué)手段進(jìn)行環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)[17]，由于傳統(tǒng)涂布平板法的局限性，DGGE作為一種分子生物學(xué)手段能夠有效的反映環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。

實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)定量檢測(cè)環(huán)境中某種特定微生物的特異性和靈敏度都很高,目前已被作為一種成熟的技術(shù)手段用于微生物生態(tài)學(xué)研究[18- 20],選擇合適的靶序列將決定PCR檢測(cè)的特異性和靈敏度，從而精確的對(duì)某種特定微生物定量[21- 23]。本文獲得了1株有綠色熒光蛋白標(biāo)記并能組成性表達(dá)的白僵菌菌株[24]，該基因是以整合到質(zhì)粒中的形式存在并轉(zhuǎn)化到白僵菌菌株中，在無(wú)篩選壓力下可以穩(wěn)定遺傳。針對(duì)綠色熒光蛋白序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物,建立了快速定量檢測(cè)水稻葉際白僵菌殘留的實(shí)時(shí)定量PCR 方法。由于白僵菌和化學(xué)農(nóng)藥乙酰甲胺磷均對(duì)水稻害蟲二化螟有防治作用，因此本實(shí)驗(yàn)在對(duì)水稻植株接種二化螟幼蟲的基礎(chǔ)上研究了不同濃度的白僵菌孢子懸液及化學(xué)農(nóng)藥對(duì)水稻葉際微生物區(qū)系及水稻保護(hù)酶系統(tǒng)的影響，評(píng)價(jià)白僵菌的生物安全性并在同一體系中比較生物農(nóng)藥和化學(xué)農(nóng)藥的生態(tài)影響，為白僵菌的使用提供指導(dǎo)和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

(1)供試土壤 供試盆栽土壤取自南京師范大學(xué)植物園，土壤pH值5.97，有機(jī)質(zhì)1.08%，總氮1.21 g/kg，速效氮98.64 mg/kg，總磷0.39 g/kg，速效磷24.67 mg/kg，總鉀0.73 g/kg，速效鉀67.58 mg/kg。

(2)供試水稻(Oryzasativa) 水稻品種為武育粳D1，購(gòu)于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

(3)供試二化螟(Chilosuppressalis) 二化螟幼蟲由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)高建芬副教授贈(zèng)送。

(4)供試白僵菌(Beauveriabassiana) 白僵菌菌株Bb0062 (帶有草丁膦抗性標(biāo)記基因bar和表達(dá)綠色熒光蛋白基因egfp)由西南農(nóng)業(yè)大學(xué)裴炎教授贈(zèng)送；將GFP標(biāo)記的白僵菌菌株進(jìn)行擴(kuò)繁處理，并進(jìn)行熒光檢測(cè)，確定該白僵菌有很強(qiáng)的熒光活性。將平板上培養(yǎng)好的白僵菌刮取孢子并用無(wú)菌去離子水清洗并制成不同濃度孢子懸液用于實(shí)驗(yàn)。

(5)供試化學(xué)農(nóng)藥 化學(xué)農(nóng)藥為乙酰甲胺磷，購(gòu)于農(nóng)藥市場(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

盆栽試驗(yàn)地點(diǎn)在南京師范大學(xué)植物園。試驗(yàn)共設(shè)7個(gè)處理，各6次重復(fù)。處理分別為CK (空白)、A (接種二化螟幼蟲)、B (1倍，即白僵菌施用濃度7.5×104孢子/mL)、C (10倍)、D (100倍)、E (1000倍)和F (化學(xué)農(nóng)藥)處理組(除空白處理組外均接水稻害蟲二化螟幼蟲)，白僵菌處理組每盆噴灑白僵菌孢子懸液40 mL，化學(xué)農(nóng)藥施用量按說(shuō)明操作。試驗(yàn)用桶高70 cm，桶口直徑30 cm，每桶放置過篩土20 kg。2012年5月1日育苗，待幼苗長(zhǎng)至10—15 cm高時(shí)將其移秧至新桶中，每桶4穴。整個(gè)盆栽試驗(yàn)期間，視土壤含水量狀況不定時(shí)灌澆自來(lái)水，定期拔除雜草。各處理組用3 m × 0.7 m × 1.5 m防蟲網(wǎng)遮蓋并用竹竿固定。于7月10日接種二化螟幼蟲并施用白僵菌孢子懸液和化學(xué)農(nóng)藥。

分別在噴施當(dāng)天，噴施后第10、30天和第60天，帶無(wú)菌手套，采用打孔器采集水稻葉片，每個(gè)重復(fù)約5—6g葉片立即放入無(wú)菌樣品袋中并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。從同一處理的每個(gè)重復(fù)中各取1 g均勻混合并提取葉際總基因組，各重復(fù)的剩余部分去除葉脈后取0.5 g單獨(dú)進(jìn)行酶活力的測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 白僵菌綠色熒光蛋白的引物設(shè)計(jì)

使用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物(eGFP-F1/eGFP-R1)擴(kuò)增標(biāo)記白僵菌的綠色熒光蛋白的一段序列，PCR產(chǎn)物為289 bp。上下游引物序列分別是(eGFP-F1: 5′CAGTGCTTCAGCCGCTACCC3′, eGFP-R1: 5′AGT-TCACCTTGATGCCGTTCTT3′)。

1.3.2 實(shí)時(shí)定量PCR

實(shí)時(shí)定量PCR 擴(kuò)增使用Step OneTM(ABI，USA)定量PCR 儀。熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線使用梯度稀釋的白僵菌基因組DNA為模板。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)為25 μL體系:2 μL DNA 模板,上下游引物各1 μL,10 μL SYBR PremixExTaq, ROX 0.4 μL,H2O 6 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序: 94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，60℃ 50 s，40 個(gè)循環(huán)。所有的熒光定量PCR反應(yīng)條件和體系完全一致。

1.3.3 POD、SOD、CAT 3種酶活力測(cè)定

水稻葉片的POD、SOD、CAT 3種酶活力的測(cè)定使用南京建成公司試劑盒，其活性以每mg可溶性蛋白的催化活力U表示。

1.3.4 葉際微生物的分離及DNA提取

葉際微生物的分離方法參見文獻(xiàn)[25]，提取后的菌體沉淀使用Ultra CleanTMSoil DNA Isolation試劑盒(Mo BIO Laboratories) 提取DNA，然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.5 PCR 擴(kuò)增和變性梯度凝膠電泳(DGGE)

DNA 的PCR 擴(kuò)增條件見表1,反應(yīng)體系均為50 μL體系：10×PCR 緩沖液5μL，MgCl23.5μL (20 mmol/L)，dNTP 2μL (10 mmol/L),上下游引物各1μL (10 μmol/L)，TaqDNA 聚合酶(REGEN BIOTEC公司)0.3 μL (1.5 U)，DNA模板1 μL (15 ng)，無(wú)菌超純水36 μL。PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)。使用CBS-DGGE 電泳系統(tǒng)(CBS Scientific Co.)進(jìn)行變性梯度凝膠電泳(DGGE)，聚丙烯酰胺凝膠濃度和變性梯度見表1，電泳緩沖液為1×TAE，PCR 產(chǎn)物上樣量為500 ng，60 ℃，100 V 電泳12 h，EB 染色20 min，UVP 凝膠影像分析系統(tǒng)拍照。

表1 PCR-DGGE條件

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用算術(shù)平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，應(yīng)用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行方差分析，(One-Way ANOVA) 檢驗(yàn)處理間差異顯著性，并用Duncan 法進(jìn)行多重比較，當(dāng)P<0.05 時(shí)，各個(gè)處理間存在顯著差異。使用Excel 2007 進(jìn)行作圖。

DGGE 指紋圖譜使用Gelcompar Ⅱ 軟件分析。其中，聚類分析使用UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic averages) 方法。用于計(jì)算群落生物多樣性的指標(biāo)有：

(1) Shannon 指數(shù)H=-∑(ni/N) ln(ni/N)

式中,ni為單一條帶的峰面積；N為所有峰的總面積。

(2) 條帶數(shù)量S，為所在泳道的條帶總數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光定量PCR檢測(cè)白僵菌在水稻葉際的殘留

2.1.1白僵菌綠色熒光蛋白特異性引物設(shè)計(jì)及驗(yàn)證

通過對(duì)白僵菌綠色熒光蛋白序列的擴(kuò)增效果及特異性驗(yàn)證篩選了一對(duì)合適的引物eGPF-F1 (5′-C AGTGCTTCAGCCGCTACCC - 3′)/eGFP-R1(5′-AGTTCACCTTGATGCCGTTCTT- 3′)。從圖1中可以看出，使用eGPF-F1/eGFP-R1進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，可以得到單一的擴(kuò)增條帶。

圖1 使用引物eGPF-F1/eGFP-R1擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜

2.1.2 白僵菌定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用梯度稀釋的白僵菌基因組DNA做為模板，引物為eGPF-F1/eGFP-R1。圖2為白僵菌基因組熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)(x)為模板質(zhì)量，縱坐標(biāo)(y)為達(dá)到熒光閾值的循環(huán)數(shù)量即Ct值(y= -3.603x+28.351)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R2>0.99)，這表明白僵菌基因組DNA質(zhì)量在10-1—103pg之間能夠很好地線性定量擴(kuò)增。同時(shí)，將白僵菌基因組DNA繼續(xù)稀釋至10-2pg、10-3pg、10-4pg、10-5pg、10-6pg，用1 μL超純無(wú)菌水作對(duì)照進(jìn)行擴(kuò)增，研究該方法的檢測(cè)極限，1 fg/μL白僵菌基因組DNA為模板及1 μL超純無(wú)菌水代替DNA模板做為陰性對(duì)照均未能擴(kuò)增，表明該體系的檢測(cè)下限為10 fg/μL白僵菌基因組DNA質(zhì)量，能夠滿足一般檢測(cè)需要。

圖2 白僵菌基因組實(shí)時(shí)定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.3 水稻葉際白僵菌殘留量的跟蹤檢測(cè)

從CK、A、B、C、D、E、F總共7個(gè)處理中分別提取葉際總DNA，進(jìn)行定量PCR。在所有的采樣時(shí)間點(diǎn)，CK、A、F處理中都沒有檢測(cè)到白僵菌的存在，說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)處理中及后續(xù)時(shí)期白僵菌并未污染此3組處理，能夠更好的進(jìn)行各處理組之間的比較。由圖3可以看出，在分別噴施1倍、10倍、100倍、1000倍白僵菌孢子懸液的B、C、D、E處理組中，在噴施后的第0、10、30天內(nèi)均檢測(cè)到了白僵菌的存在，而在第60天時(shí)4個(gè)處理組中均未檢測(cè)到白僵菌的存在，說(shuō)明白僵菌可以在水稻葉片殘留至少達(dá)30 d之久。其中1000倍白僵菌處理即E處理組葉際白僵菌DNA含量在第0天為log102.93 (pg DNA/g葉片)，而在第30天時(shí)為log100.69 (pg DNA/g葉片)，衰減了99.42%，而D、C、B處理組的葉際白僵菌含量分別衰減了97.91%、92.41%、74.30%。說(shuō)明了白僵菌噴施濃度越大，衰減速度越快，因此在噴施時(shí)應(yīng)注意濃度不用過大，以免造成不必要浪費(fèi)。

圖3 定量PCR研究水稻葉際白僵菌DNA 含量變化

2.2 白僵菌對(duì)水稻酶活力影響

2.2.1 白僵菌對(duì)水稻超氧化物歧化酶活力影響

超氧化物歧化酶SOD是目前為止發(fā)現(xiàn)唯一以超氧陰離子自由基為底物的酶，對(duì)于維護(hù)植物體內(nèi)動(dòng)態(tài)平衡起著重要作用[26]，具有防御活性氧毒性等功效。由圖4可知，超氧化物歧化酶活性在整個(gè)周期中隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低。白僵菌處理能提高水稻超氧化物歧化酶活性，其中以10—30 d效果最為明顯，在第10天時(shí)D處理組相比較CK提高了20.38%，而A處理組相比較CK略有下降，推測(cè)二化螟蟲害導(dǎo)致水稻酶活力下降，到成熟期，各處理組超氧化物歧化酶活力趨于一致。

圖4 不同處理對(duì)SOD活性的影響

2.2.2 白僵菌對(duì)水稻過氧化物酶活力影響

過氧化物酶主要起到酶促降解H2O2的作用，解除細(xì)胞內(nèi)有害自由基。由圖5可知，過氧化物酶活性在整個(gè)周期中呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，到第60天時(shí)達(dá)到最大值。白僵菌對(duì)過氧化物酶活力影響較小，在第10天時(shí)，F(xiàn)處理組水稻過氧化物酶活力較高，推測(cè)是由于植物的應(yīng)激反應(yīng)所導(dǎo)致。

圖5 不同處理對(duì)POD活性的影響

2.2.3 白僵菌對(duì)水稻過氧化氫酶活力影響

過氧化氫酶CAT可以分解H2O2形成O2和H2O，與植物代謝強(qiáng)度及抗逆能力密切相關(guān)[27]。由圖6可以看出，在整個(gè)周期內(nèi)隨著時(shí)間延長(zhǎng)，過氧化氫酶活力逐漸下降。F和A處理組過氧化氫酶活力較低，推測(cè)病蟲害及化學(xué)農(nóng)藥均會(huì)降低過氧化氫酶活力，其中在第10天 時(shí)，A和F處理組相比較CK分別下降了19.55%和42.70%，化學(xué)農(nóng)藥處理導(dǎo)致酶活力下降幅度更大，在第30天 時(shí)4個(gè)白僵菌處理組過氧化氫酶活力均提高，其中C處理組相比較CK提高了33.67%，而在第60天 時(shí)，A處理組酶活力仍未恢復(fù)。

圖6 不同處理對(duì)CAT活性的影響

2.3 白僵菌對(duì)水稻葉際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 水稻葉際細(xì)菌DGGE分析

由圖7和表2可以看出，白僵菌對(duì)水稻葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響較小，但聚類分析表明在同一時(shí)期內(nèi)各處理組聚成一類，說(shuō)明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)隨時(shí)間具有一定波動(dòng)性，而同一時(shí)期內(nèi)各白僵菌處理組之間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較相似，相比較其他處理組，條帶數(shù)及香農(nóng)指數(shù)有所提高。

圖7 水稻葉際細(xì)菌群落DGGE指紋圖譜聚類分析

2.3.2 水稻葉際真菌DGGE分析

由圖8和表3可知，真菌的群落結(jié)構(gòu)變化表現(xiàn)出與細(xì)菌相似的特點(diǎn)，即同一時(shí)期的各處理組聚成一簇，而白僵菌處理組群落結(jié)構(gòu)較類似，并且在后期條帶數(shù)及香農(nóng)指數(shù)相比較其他處理組有所提高。A處理組和F處理組條帶數(shù)及香農(nóng)指數(shù)均較小。

圖8 水稻葉際真菌群落DGGE指紋圖譜聚類分析

表2 葉際細(xì)菌群落多樣性

表3 葉際真菌群落多樣性

3 討論

雖然微生物農(nóng)藥白僵菌應(yīng)用較廣泛，但國(guó)內(nèi)外目前尚沒有關(guān)于白僵菌對(duì)植物葉際影響的研究。本文首次對(duì)微生物農(nóng)藥白僵菌在葉際的生態(tài)影響做了較為全面的評(píng)價(jià)，并首次在同一系統(tǒng)中比較了生物農(nóng)藥白僵菌與化學(xué)農(nóng)藥對(duì)植物葉際的不同生態(tài)影響。

3.1 白僵菌在環(huán)境中的殘留

生防菌能否起到穩(wěn)定、持久的防病效果的重要因素就是其在植物根際能否有效定殖[28]。而研究生防菌在葉際的定殖對(duì)于評(píng)價(jià)其作用效果也至關(guān)重要。微生物農(nóng)藥在施用后面臨著衰減殘留情況的檢測(cè)問題，傳統(tǒng)抗生素標(biāo)記及放射性同位素標(biāo)記等技術(shù)手段難以直觀、準(zhǔn)確區(qū)分土著微生物和人工接種微生物[29]，綠色熒光蛋白作為分子標(biāo)記應(yīng)用較廣，其對(duì)細(xì)胞無(wú)毒，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[30]，但是熒光表達(dá)需要一定條件，在脅迫、寡營(yíng)養(yǎng)階段或特殊生長(zhǎng)階段也會(huì)出現(xiàn)熒光表達(dá)較弱的問題。本文建立了一種使用SYBR Green I 熒光染料快速檢測(cè)葉際白僵菌殘留的方法。SYBR Green I 的特異性主要依靠設(shè)計(jì)的PCR 引物的特異性。根據(jù)白僵菌綠色熒光蛋白序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物eGFP-F1和eGFP-R1，驗(yàn)證特異性、靈敏性均較高，結(jié)果表明白僵菌可以在水稻葉際殘留至少達(dá)30 d，本研究在試驗(yàn)期間受多次的降水、大風(fēng)的氣候因素的影響，推測(cè)白僵菌能夠與水稻由附生轉(zhuǎn)變?yōu)榘爰纳鸂顟B(tài)。殷幼平等研究發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白標(biāo)記的枯草芽孢桿菌在柑橘葉際定殖達(dá)42 d之久[31]，然而并未比較不同濃度的生防菌衰減速率，本文研究發(fā)現(xiàn)白僵菌初始噴施濃度越大，其在葉際的衰減速率越快，其中在第30天時(shí)B處理組白僵菌殘留量是初始量的25.70%，而E處理組白僵菌殘留量是初始量的0.58%。

3.2 白僵菌對(duì)水稻抗氧化酶活力研究

SOD、POD、CAT作為保護(hù)酶系統(tǒng)的主要指標(biāo)，能夠反映植物的生理代謝水平。而目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)植物保護(hù)酶系統(tǒng)的影響因素研究主要局限于化學(xué)農(nóng)藥[32]、重金屬離子[33- 34]、內(nèi)生菌[35]、鹽脅迫[36]、礦質(zhì)元素[37]等，關(guān)于微生物農(nóng)藥對(duì)植物保護(hù)酶系統(tǒng)的影響研究較少。本文研究發(fā)現(xiàn)白僵菌處理能夠提高水稻超氧化物歧化酶及過氧化氫酶活力，并且不同濃度白僵菌處理組之間酶活力相差較小，白僵菌能夠與植物互作，改善植物生長(zhǎng)狀態(tài)，推測(cè)一方面白僵菌可以拮抗植物病原菌、誘導(dǎo)植物抗性[38- 39]及毒殺水稻害蟲二化螟，另一方面白僵菌可能影響水稻土壤從而間接改善植物生長(zhǎng)條件，然而具體機(jī)制目前還不清楚。在A處理組即接種二化螟處理組中，3種保護(hù)酶活力均有不同程度下降，推測(cè)保護(hù)酶活力下降是由水稻蟲害導(dǎo)致的。在F處理組即化學(xué)農(nóng)藥處理能夠降低水稻過氧化氫酶活力，對(duì)其他兩種酶活力影響較小，推測(cè)是化學(xué)農(nóng)藥引起了植物的應(yīng)激反應(yīng)。

3.3 白僵菌對(duì)水稻葉際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

總體來(lái)看，白僵菌處理并未造成葉際細(xì)菌群落較大波動(dòng)。在真菌群落結(jié)構(gòu)中，A、F處理組條帶數(shù)及香農(nóng)指數(shù)均較小，說(shuō)明水稻病蟲害及化學(xué)農(nóng)藥對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)有較大影響。在第10天時(shí)，化學(xué)農(nóng)藥處理后細(xì)菌及真菌多樣性均較小，這與荊夢(mèng)[40]等研究結(jié)果是一致的，推測(cè)由于化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致某些抗藥性菌群生長(zhǎng)而抑制其他菌群的生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致葉際菌群結(jié)構(gòu)較單一。

4 結(jié)論

本文建立了定量檢測(cè)植物葉際白僵菌殘留的熒光PCR方法，結(jié)果表明靈敏性及特異性均較高，白僵菌可以在水稻葉際殘留達(dá)30 d之久，而白僵菌是以何種方式與水稻互作尚不清楚，同時(shí)白僵菌是否可以進(jìn)入水稻葉片內(nèi)部甚至由葉片遷移到莖、根等部位也是值得研究的。另外本文研究了白僵菌對(duì)水稻保護(hù)酶活力的影響，而白僵菌是以何種機(jī)制提高水稻保護(hù)酶活力還有待闡明。最后，本文研究了白僵菌對(duì)水稻葉際的微生物群落結(jié)構(gòu)影響，DGGE聚類分析結(jié)果表明白僵菌處理后水稻葉際細(xì)菌、真菌的條帶數(shù)和香農(nóng)指數(shù)均有所升高說(shuō)明白僵菌對(duì)水稻葉際微生物群落結(jié)構(gòu)有一定影響，而白僵菌作用于水稻后對(duì)水稻內(nèi)生菌的定殖是否影響也是值得研究的，只有闡明以上問題，才能更好的理解白僵菌的作用機(jī)制，更充分的評(píng)價(jià)微生物農(nóng)藥白僵菌的生物安全性。

致謝：西南大學(xué)生物技術(shù)中心裴炎教授提供綠色熒光蛋白標(biāo)記的白僵菌菌種，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院高建芬副教授提供二化螟幼蟲,特此致謝。

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