康 婷，黃世友，李 鵬，史 婷，余 擎，段銀鐘

(1.第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院正畸科軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室，陜西西安710032;2.解放軍第422醫(yī)院，廣東湛江524005;3.成都軍區(qū)機關醫(yī)院，四川成都610000;4.河南護理職業(yè)學院，河南安陽455000)

當活細胞和有機體受到環(huán)境中的機械刺激時，機械信號隨即被轉(zhuǎn)化成生物信號，并將其整合使之表現(xiàn)為細胞反應，這一現(xiàn)象稱為機械轉(zhuǎn)導［1］。機械轉(zhuǎn)導與一大類細胞膜分子相關，主要包括離子通道、特異性細胞骨架蛋白、細胞連接分子、G蛋白耦合受體和激酶等［2-3］。在最近的研究中，學者們多傾向于將離子通道作為一種具有傳導性的分子，并已確定了最有可能的分子種類。目前認為，機械敏感性通道(Mechanosensitive channel，MSCs)或稱為機械門控性通道(Mechano-gated channel)，是活細胞表面的機械刺激轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)電信號或化學信號時主要的機械感受器，并與細胞骨架一起構(gòu)成機械感受器體系［4-6］。壓電離子通道(Piezo)是最近發(fā)現(xiàn)的一種新型機械敏感離子通道，2010年Coste等采用RNA干擾技術(shù)通過降低Neuro2A細胞的機械反應，確定了其基因序列，并結(jié)合全細胞刺激/記錄的膜片鉗和分子生物學的方法對其進行了驗證［7］。目前，關于Piezo的特性和功能還有很多重要方面尚未明確。

牙周膜(又稱牙周韌帶)由致密的結(jié)締組織構(gòu)成，其成分主要有纖維、基質(zhì)、牙骨質(zhì)小體和細胞(成纖維細胞、成骨細胞、破骨細胞、成牙骨質(zhì)細胞以及少量干細胞)，并且有血管、神經(jīng)、淋巴管分布。牙周膜作為連接牙齒和牙槽窩的組織，不僅可以緩沖咀嚼壓力，還可承受各種正畸力，是正畸矯治的重要生物學基礎［8-10］。Piezos是與機械反應有關的基因產(chǎn)物，因其具有機械敏感性而可被機械力直接激活［11］，并參與細胞對傷害性刺激的反應［12］、細胞數(shù)量的自我平衡［13］以及細胞容積的調(diào)控［14］，在多種細胞和組織上均有其表達;但目前尚沒有研究證明Piezos蛋白在牙周組織中的表達及相關功能。本實驗擬通過間接免疫熒光技術(shù)，在蛋白水平觀察壓電離子通道Piezos蛋白在牙周組織的表達，以了解其定位特點，并結(jié)合有關Piezos離子通道生理特性的研究基礎，初步探討Piezos蛋白在牙周組織機械感受中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(第四軍醫(yī)大學動物實驗中心提供);170 g/L EDTA脫礦液(上海Sangon生物工程技術(shù)公司);0.01 mol/L檸檬酸鹽抗原修復液(自配，檸檬酸0.4 g、檸檬酸鈉2.4 g，溶于1 000 mL三蒸水中，調(diào)節(jié)pH至6.0左右);Piezo1和Piezo2兔抗大鼠多克隆抗體(Abcam，英國);Alexa Fluor? 488標記山羊抗小鼠IgG熒光二抗(北京中衫金橋生物技術(shù)公司);生物組織自動脫水機(TS-12U)、生物組織包埋機(BMIX)、攤片烤片機(CS-VI)(孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司);石蠟切片機(RM 2235，Leica公司，德國);激光共聚焦顯微鏡(FV-1000，Olympus公司，日本)。

1.2 方法

1.2.1 牙周組織標本制備和切片

取8周齡雄性SD大鼠(體質(zhì)量200 g左右，牙列完整，無畸形及齲損)，用戊巴比妥過量麻醉處死后，取雙側(cè)上頜包含后牙及其周圍牙槽骨的骨塊，置新鮮配制的40 g/L多聚甲醛液中固定24 h(4℃)。然后將固定后的各組織塊分別置50 mL 170 g/L EDTA液中進行脫鈣，每3 d更換1次脫鈣液。待針刺標本可以輕松穿透時(約2個月)，取出標本流水沖洗24 h(充分去除殘留EDTA)，并分別用600、700、800、950 mL/L(2 份次)乙醇脫水各12 h;正丁醇浸泡12 h后再分別放入無水乙醇(3份次)中脫水各12 h、1∶1乙醚/無水乙醇1 h、氯仿(3份次)各30 min;最后在57℃下浸蠟3 h。取上述處理后的各標本，分別用慢速打磨機進行修整，以便控制切片方向;然后常規(guī)石蠟包埋，并沿牙齒矢狀向作連續(xù)切片(片厚3 μm)、49℃展片、陽離子防脫載玻片撈片，60℃烤片2～3 h后用于免疫組化檢測。

1.2.2 間接免疫熒光檢測

上述組織切片常規(guī)脫蠟至水，并分別置于0.01 mol/L檸檬酸鹽抗原修復液中，微波加熱修復抗原后，滴加山羊血清封閉30 min(室溫);滴加5 μg/mL的 Piezo1抗體和 Piezo2抗體(一抗)，4 ℃孵育過夜;PBS搖洗 10 min×3次，滴加 Alexa Fluor? 488標記的山羊抗小鼠 IgG熒光二抗(1∶50稀釋)，37℃孵育1 h;PBS搖洗10 min×3次，滴加2 μg/mL的 DAPI，30℃孵育30 min進行襯染;最后滴加防淬滅封片劑封片，并置于激光共聚焦顯微鏡下進行觀察。分別在每張組織切片上確定上頜第一磨牙根中1/3部位的牙周膜后，從中隨機選擇5個視野，使用ImagePro Plus測定其灰度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，Piezo1和Piezo2的表達量比較用隨機設計t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

Piezo1和Piezo2在牙周成纖維細胞中均呈陽性表達，其中Piezo2的表達量低于Piezo1，其灰度值分別為281.9±32.4和115.5±42.2，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。但Piezo1和Piezo2兩種蛋白在不同部位牙周膜里的表達分布并不均勻(熒光強弱不一致)，在根側(cè)牙周膜成纖維細胞中Piezos的表達沿牙周主纖維的走形呈斜行分布;在靠近固有牙槽骨處的牙周膜中的成骨細胞上也有少量表達，而且在這些細胞中的表達部位集中于胞膜上，部分在胞漿里;但在固有牙槽骨中的骨細胞中未見有Piezos蛋白的特異性陽性表達，只在牙槽骨的孔隙中有團狀的陽性表達(圖1～2)。

圖1 Piezo1在牙周組織中的表達

圖2 Piezo2在牙周組織中的表達

3 討論

牙周膜中有大量縱橫交錯的膠原纖維束，其間布滿細胞和組織液，而這些血液來源的組織液充滿了牙周膜的所有空腔。牙周膜之所以能在復雜的咀嚼運動中有效地發(fā)揮減震器的功能，正是因為具備了這種多液體、多孔、富有彈性的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，而其形態(tài)的維持依賴于咬合力對牙周組織的刺激［15］。體內(nèi)研究證明，牙周膜內(nèi)的基質(zhì)細胞，特別是成纖維細胞和成骨細胞均具有獲得機械信號的效應器，不但能夠感受機械力，還可產(chǎn)生一系列維持牙周膜寬度和保護細胞的多樣性的反應［16］。牙周膜和牙槽骨的細胞特征表明，當咀嚼力作用于牙齒時，可由牙周膜來完成牙槽骨的快速改建［17-18］。因此，咀嚼力下的牙周膜機械轉(zhuǎn)導決定了牙槽骨骨量和牙周膜形態(tài)的維持［19］。機械轉(zhuǎn)導與離子通道、特異性細胞骨架蛋白等有密不可分的關系，而Piezos離子通道則是一類具有傳導性的分子，并因其能快反應而成為效率很高的壓力感受器［20］;但牙周膜成纖維細胞是否也表達該通道蛋白，目前尚未見相關報道。

本實驗通過間接免疫熒光標記觀察發(fā)現(xiàn)，Piezo1和Piezo2蛋白在牙周膜中均呈陽性表達，其中Piezo1的表達量明顯高于Piezo2，與Coste等［7］報道的Piezo2比Pierol表達水平更低的結(jié)果類似。雖然不能排除其他離子通道在牙周膜感受機械力時的作用，但由于Piezos離子通道具有完整的機械敏感性［7］，仍然可以推測該通道在牙周膜中可能具有獨立的機械敏感感知功能;并且可能存在與其他離子通道不同的激活模式。本實驗中發(fā)現(xiàn)，固有牙槽骨中的成熟骨細胞未見Piezos的表達，而在牙周膜成纖維細胞中有大量表達。由此可以推測，在非外力移動牙齒的狀態(tài)下，牙周膜中的成纖維細胞伴隨牙周膜主纖維生長，處在感受咀嚼力的前沿，連同位于固有牙槽骨表面的成骨細胞一起，可能都是活躍的Piezos離子通道表達細胞。雖然細胞感知咀嚼力引起的形變、壓力和受力的分子機制仍不夠清楚，但是根據(jù)該離子通道的表達情況，至少可以推測其參與了牙周膜感知的功能。

本實驗證實了牙周組織，特別是牙周膜中有豐富的機械敏感性離子通道 Piezos的表達，其中Piezo2的表達量明顯低于Piezo1。鑒于牙周膜是牙周組織中對牙齒受到的機械力刺激進行感受的第一效應器，而Piezos作為一個在其他組織中已被證實與細胞機械轉(zhuǎn)導及傷害性感受有關的機械敏感離子通道，可能在其中扮演了感受器的角色。該發(fā)現(xiàn)為進一步研究牙周組織對于咀嚼力、正畸力的分子生物學反應奠定了一定的基礎。

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