劉 朋, 殷俐娜,2, 王仕穩(wěn),2, 鄧西平,2

(1.中國科學(xué)院 水利部 水土保持研究所 黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國家重點實驗室,陜西 楊凌 712100; 2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 水土保持研究所, 陜西 楊凌 712100)

鎘脅迫下硅對高粱生長的影響及其作用機制

劉 朋1, 殷俐娜1,2, 王仕穩(wěn)1,2, 鄧西平1,2

(1.中國科學(xué)院 水利部 水土保持研究所 黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國家重點實驗室,陜西 楊凌 712100; 2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 水土保持研究所, 陜西 楊凌 712100)

盡管硅提高植物的抗鎘毒害已經(jīng)被廣泛的報道，但是其作用機理還不明確。該試驗研究在鎘脅迫的條件下，硅對高粱生長的影響及作用機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：外源施加硅能顯著地緩解鎘對高粱無論地上部分還是地下部分鮮重及干重的抑制作用?？寡趸附Y(jié)果表明：在正常條件下，硅對抗氧化酶的活性沒有顯著的影響。在鎘毒害的條件下，硅顯著增強CAT和POD的活性，SOD的活性不受影響。與此相對應(yīng)：硅顯著地降低MDA的含量。對有機酸的分析發(fā)現(xiàn)：在鎘脅迫的條件下，葉片中有3種有機酸能夠檢測到：草酸，丙二酸，丁二酸，并且其含量都在硅的調(diào)節(jié)下增加。而在根系中所檢測的4種有機酸中，草酸和丙二酸的含量受到硅的調(diào)節(jié)而增加，檸檬酸的含量不受影響，而蘋果酸的含量卻有下降的趨勢。上述結(jié)果表明：硅增強高粱幼苗的抗鎘脅迫與其增強高粱抗氧化酶活性及增加高粱體內(nèi)有機酸的含量相關(guān)。

硅; 鎘; 抗氧化酶; 有機酸

土壤的重金屬污染是一個非常嚴(yán)重的環(huán)境問題。鎘(Cd)由于其具有非常強的流動性和毒害性，在世界范圍內(nèi)受到越來越多的重視[1]。黃土高原地區(qū)由于煤炭的開采導(dǎo)致土壤中富集了大量的鎘[2]。土壤中大量富集的鎘對植物的生長產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，在高濃度的情況下會導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[3-4]。黃土高原作為我國糧食作物和水果的主產(chǎn)區(qū)之一，土壤中的鎘嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量及果實的品質(zhì)。因此，需要采取一些方法增強植物抗鎘能力，其中外源施加非毒性的化學(xué)試劑是增強植物抗鎘毒害的方法之一。

硅在地殼中的含量僅次于氧，位居第二位[5]。盡管到目前為止，硅還不被廣泛的認(rèn)定為一種植物生長的必需元素，但是其在調(diào)控植物增強對生物脅迫和非生物脅迫的抵抗作用上已被大量的報道[6-9]。很多的研究結(jié)果表明：硅增強植物對鎘的抵抗性其中一個重要的原因就是外源施加硅能改善植物對鎘的吸收和運輸。Chen等[10]的試驗結(jié)果表明：高濃度的硅施入土壤后明顯提高了土壤的pH從而降低了鎘的有效性，減少了植物體對鎘的吸收。Vaculik等[3]對根系固定鎘的作用進(jìn)行了進(jìn)一步分析，結(jié)果表明：外源施加硅可以促進(jìn)質(zhì)外體物理障礙的形成和維管束系統(tǒng)的成熟從而減少了根對鎘的吸收及向地上部分的運輸。過去很多試驗對于硅提高植物抗鎘毒害的作用都是建立在長期毒害的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。但是在我們的預(yù)試驗中發(fā)現(xiàn)，在短期毒害下(72 h)硅也能顯著提高高粱對鎘毒害的抗性，因此在硅提高高粱抗鎘毒害的機理中還存在著其他作用機制?；趪鴥?nèi)外的研究進(jìn)展，本試驗主要研究在鎘毒害的條件下，外源施加硅對高粱幼苗生長的影響，并且在此基礎(chǔ)上研究高粱體內(nèi)有機酸及抗氧化系統(tǒng)的變化趨勢。

1 試驗材料與方法

本試驗選用高粱(SorghumbicolorMoench.cv.Gadambalia)作為試驗材料。通過水培的方式研究外源施加硅對高粱生長的影響及其作用機制。

1.1 培養(yǎng)條件

高粱種子用1%的次氯酸鈉滅菌后，將其放進(jìn)育苗箱內(nèi)催芽3 d。然后選取健壯，大小一致的高粱幼苗移栽至1/4倍Hoagland營養(yǎng)液中進(jìn)行水培。水培試驗是在黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國家重點實驗室人工氣候室內(nèi)進(jìn)行。移栽6 d后，在營養(yǎng)液中加入1.67 mmol的Na2SiO3。硅處理三天后，進(jìn)行鎘毒害處理。鎘毒害的濃度為10 μmol。在整個幼苗的生長過程中，每天用HCl和KOH調(diào)節(jié)營養(yǎng)液的pH值為6.0，并且保持通氣。本試驗一共4個處理：對照；對照+硅；鎘；鎘+硅。

1.2 生物量的測定

經(jīng)過三天的鎘毒害處理后，分別稱取高粱幼苗的地上部分及根系的鮮重，然后將其放在70℃的烘箱烘干，測定其干重。

1.3 抗氧化酶活性及MDA的測定

經(jīng)過三天的鎘毒害處理后，對葉片進(jìn)行取樣分別測定抗氧化酶活性和MDA的含量。測定方法參見植物生理學(xué)試驗指導(dǎo)[11]。

1.4 有機酸含量的測定

稱取0.5 g樣品，用6 ml蒸餾水進(jìn)行研磨。研磨液于75℃水浴中提取15 min。然后以20 000 rpm離心20 min。上清液過0.45 μm濾膜后通過HPLC[12](Shimadzu,UV detector,Japan)分析各種有機酸的含量。HPLC的測定條件為：色譜柱為ODS-AQ column(250 mm×4.6 mm;5 μm particle size)；流動相為20 mmol NH4H2PO4，pH用H3PO4調(diào)至2.5；流速設(shè)定為0.7 ml/min；柱溫25℃；波長210 nm。各種有機酸的含量通過有機酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算。

1.5 統(tǒng)計方法

利用Excel作圖，SPSS在(P<0.05)水平上進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源施加硅對高粱幼苗干重和鮮重的影響

結(jié)果如表1所示，在正常條件下，外源施加硅對生物量及根冠比沒有顯著影響。當(dāng)高粱幼苗經(jīng)過3 d的鎘毒害處理后，無論是地上部分還是地下部分生物量(鮮重和干重)都出現(xiàn)顯著下降。但是經(jīng)過硅處理后的幼苗，其生物量下降的趨勢得到顯著緩解。盡管在鎘脅迫下，外源施加硅可以顯著增加高粱幼苗的鮮重和干重，但是其根冠比并沒有受到顯著影響。

表1 鎘脅迫下硅對高粱幼苗地上部分和根鮮重，干重及根冠比的影響

注：不同字母代表P<0.05上有顯著差異。

2.2 外源施加硅對抗氧化酶活性及MDA含量的影響

從圖1可以看出，無論在正常條件還是在鎘脅迫的條件下，外源施加硅對SOD的活性沒有顯著影響。當(dāng)高粱幼苗遭遇到鎘毒害后，CAT活性顯著增強，而外源施加硅后，CAT活性會得到進(jìn)一步的增強。POD活性在正常條件下沒有顯著性的差異，但是在鎘毒害的條件下，外源施加硅可以明顯增強POD的活性。與上述抗氧化酶活性相對應(yīng)的就是MDA的含量。高粱幼苗遭受到鎘脅迫后，由于細(xì)胞膜的完整性受到嚴(yán)重的破壞，MDA的含量顯著上升。而外源施加硅后，抗氧化酶活性的增強緩解了膜脂過氧化作用，維持了細(xì)胞膜的完整性，從而降低MDA的合成。

圖1 鎘脅迫下硅對高粱幼苗葉片SOD，CAT，POD活性及MDA含量的影響

2.3外源施加硅對葉片有機酸含量的影響

在本試驗中，使用了6種有機酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品來測定高粱葉片和根系內(nèi)有機酸的含量。通過與標(biāo)準(zhǔn)樣品保留時間的比較，我們發(fā)現(xiàn)在高粱幼苗的葉片中可以檢測到三種有機酸即：草酸，丙二酸和丁二酸(圖2)。但是它們的變化趨勢并不完全相同。在沒有鎘毒害存在的情況下，外源加入硅顯著增加草酸的含量。高粱幼苗經(jīng)過3 d的鎘處理后，地上部分中草酸的含量大幅度下降，但是經(jīng)過硅處理的葉片中的草酸含量仍然要顯著高于未加硅的幼苗。丙二酸的含量在正常條件沒有受到外源施加硅的影響。經(jīng)過鎘處理后，未加硅處理的幼苗葉片丙二酸的含量仍然沒有顯著性的變化，但是經(jīng)過硅處理的幼苗葉片丙二酸的含量顯著增加。正常條件下，丁二酸的變化趨勢與丙二酸相似，沒有受到外源施加硅的影響，但是當(dāng)高粱幼苗遭受到鎘脅迫后，葉片中丁二酸大量積累并顯著高于對照，值得注意的一點就是：外源施加硅可以進(jìn)一步增加葉片中丁二酸的積累量。

圖2 鎘脅迫下硅對高粱幼苗葉片有機酸含量的影響

2.4外源施加硅對根系有機酸含量的影響

根系有機酸的種類，含量與葉片中的結(jié)果不同(圖3)。相比與葉片中有機酸的種類，根系中蘋果酸和檸檬酸能被檢測到，但是丁二酸卻沒有檢測到。草酸的含量在根系中各種有機酸中是最高的。無論在正常還是鎘脅迫的條件下，外源施加硅都能顯著地增加根系草酸的含量。蘋果酸的變化趨勢與其他幾種有機酸的變化趨勢完全不同，外源施加硅對蘋果酸的含量起到了負(fù)作用。無論在正常還是鎘存在的條件下，外源施加硅都減少了蘋果酸的含量。根系中丙二酸在正常條件下沒有受到外源施加硅的影響。但是當(dāng)高粱幼苗遭受到鎘脅迫后，丙二酸的含量顯著增加，并且硅可以明顯地提高丙二酸的增加幅度。檸檬酸的含量在正常條件下受到外源施加硅的負(fù)調(diào)節(jié)。經(jīng)過3 d鎘毒害處理后，根系中檸檬酸的含量顯著地增加，并且其含量不受到外源施加硅的影響。

圖3 鎘脅迫下硅對高粱幼苗根系有機酸含量的影響

3 討論與結(jié)論

由于鎘有非常強的流動性，因此其可以在植物體內(nèi)任何組織積累對植物的生長產(chǎn)生抑制作用。過去的研究表明：大量鎘的積累會通過改變?nèi)~綠體的超微結(jié)構(gòu)[13]，降低光合作用相關(guān)基因的表達(dá)[14]，抑制與CO2固定相關(guān)酶的活性來降低植物的光合速率，從而引起植物生物量的減少[15]。外源施加硅后對鎘毒害的緩解作用已經(jīng)在很多植物中得到驗證，例如：在玉米和黃瓜[3,16]中外源施加硅都能增強其抗鎘毒害的能力。在本試驗中，正常條件下，外源施加硅對高粱幼苗的生物量沒有明顯影響。但是當(dāng)經(jīng)過3 d鎘毒害后，外源施加硅能顯著地增加地下部分和地上部分的生物量。所以，本試驗的結(jié)果也能證明，外源施加硅能顯著地增強高粱幼苗對鎘毒害的抵抗作用。

對于硅增強植物抗鎘毒害的作用機理已經(jīng)在很多方面進(jìn)行了廣泛的研究。其中一個重要的作用機制就是外源施加硅能增強植物的抗氧化能力，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，從而增強植物的抗鎘毒害的能力。Luka?ová等[17]的研究結(jié)果表明：當(dāng)玉米遭遇到高濃度的鎘脅迫時，外源施加硅能顯著地增強SOD，POX的活性而CAT的活性卻受到硅的抑制。當(dāng)用小白菜作為研究材料，研究硅對抗氧化酶活性影響的時候發(fā)現(xiàn)：SOD，CAT，APX的活性都由于外源施加硅而得到顯著增強[18]。本試驗中，在鎘處理的條件下，外源施加硅能顯著增強POD，CAT的活性，而SOD的活性沒有顯著變化。這些結(jié)果說明：硅在調(diào)節(jié)植物抗氧化酶活性方面隨著植物種類的不同而不同。

除了外源施加硅能改善植物的抗氧化能力之外，關(guān)于硅在鎘吸收及運輸過程中所起的物理屏障的作用受到越來越廣泛的重視。對這些試驗進(jìn)行分析我們發(fā)現(xiàn)：這些試驗鎘處理的時間都相對較長(大于7 d)，這樣有利于根系木栓化形成。本試驗在水培中進(jìn)行，這樣的培養(yǎng)條件不利于木栓化的形成，并且我們處理的時間尺度也相對較短，所以我們認(rèn)為還存在其它作用機制。過去很多研究表明：植物體內(nèi)大量合成的有機酸通過硫醇?xì)埢c重金屬元素螯合能增強植物對重金屬毒害的抗性[19-20]。并且有試驗已經(jīng)證明在重金屬脅迫的條件下硅能促進(jìn)有機酸的合成。當(dāng)玉米遭遇到重金屬毒害時，外源施加硅能促進(jìn)有機酸的分泌，從而增強玉米對重金屬毒害的抵抗性[21]。因此，在本試驗中我們也測定了有機酸含量的變化趨勢。試驗結(jié)果表明：無論是在根系還是葉片，在鎘脅迫的條件下外源施加硅能增加有機酸的含量。這個結(jié)論在我們的試驗中是首次發(fā)現(xiàn)的。值得注意的一點是：盡管根系蘋果酸的含量有所下降，但是這并不影響硅通過增加有機酸的含量來增強高粱的抗鎘毒害能力。因為蘋果酸的含量要遠(yuǎn)低于其他幾種有機酸尤其是草酸的含量。大量合成的有機酸一方面通過與鎘螯合降低其毒性，另一方面有機酸與鎘的螯合物沉積在細(xì)胞壁上也能降低鎘的毒性[19]。到目前為止，關(guān)于硅調(diào)控植物生理和分子活動的作用機制的研究還沒有取得突破性的進(jìn)展，所以關(guān)于硅如何調(diào)控不同有機酸的合成還需要進(jìn)一步的研究。

本試驗的結(jié)果表明：當(dāng)高粱幼苗遭受到鎘脅迫后，外源施加硅能顯著地緩解鎘對高粱幼苗生長造成的影響。在此基礎(chǔ)上我們又進(jìn)一步深入的探討其作用機理。一方面：硅能增強高粱體內(nèi)抗氧化酶的活性，減輕鎘毒害造成的膜脂過氧化；另一方面，外源施加硅還能促進(jìn)高粱體內(nèi)有機酸大量合成，從而引起鎘毒性的降低。

[1] Clemens S. Toxic metal accumulation, responses to exposure and mechanisms of tolerance in plants[J]. Biochimie,2006,88(11):1707-1719.

[2] 王麗,王力,和文祥,等.神木煤礦區(qū)土壤重金屬污染特征研究[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報,2011,20(8):1343-1347.

[3] Vaculík M, Landberg T, Greger M, et al. Silicon modifies root anatomy, and uptake and subcellular distribution of cadmium in young maize plants[J]. Annals of Botany,2012,110(2):433-443.

[4] 劉勁松,石輝,李秧秧.鎘脅迫對黃瓜幼苗光合和葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊慬J].水土保持研究,2012,18(5):187-190.

[5] Epstein E. Silicon[J]. Annual Review of Plant Biology,1999,50(1):641-664.

[6] Garbuzov M, Reidinger S, Hartley S E. Interactive effects of plant-available soil silicon and herbivory on competition between two grass species[J]. Annals of Botany,2011,108(7):1355-1363.

[7] Dallagnol L J, Rodrigues F A, Tanaka F A O, et al. Effect of potassium silicate on epidemic components of powdery mildew on melon[J]. Plant Pathology,2012,61(2):323-330.

[8] Gong H, Zhu X, Chen K, et al. Silicon alleviates oxidative damage of wheat plants in pots under drought[J]. Plant Science,2005,169(2):313-321.

[9] Hattori T, Sonobe K, Araki H, et al. Silicon application by sorghum through the alleviation of stress-induced increase in hydraulic resistance[J]. Journal of Plant Nutrition,2008,31(8):1482-1495.

[10] Chen H M, Zheng C R, Tu C, et al. Chemical methods and phytoremediation of soil contaminated with heavy metals[J]. Chemosphere,2000,41(1):229-234.

[11] 高俊鳳.植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[M].北京：高等教育出版社,2006.

[12] Pinto A P, Simoes I, Mota A M. Cadmium impact on root exudates of sorghum and maize plants: a speciation study[J]. Journal of Plant Nutrition, 2008,31(10):1746-1755.

[13] Souza V L, de Almeida A A F, Lima S G C, et al. Morphophysiological responses and programmed cell death induced by cadmium inGenipaamericanaL.(Rubiaceae)[J]. Biometals,2011,24(1):59-71.

[14] Qian H, Li J, Pan X, et al. Photoperiod and temperature influence cadmium’s effects on photosynthesis-related gene transcription inChlorellavulgaris[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety,2010,73(6):1202-1206.

[15] Perfus-Barbeoch L, Leonhardt N, Vavasseur A, et al. Heavy metal toxicity: cadmium permeates through calcium channels and disturbs the plant water status[J]. The Plant Journal,2002,32(4):539-548.

[16] Liang Y, Wong J W C, Wei L. Silicon-mediated enhancement of cadmium tolerance in maize (ZeamaysL.) grown in cadmium contaminated soil[J]. Chemosphere,2005,58(4):475-483.

[17] Luka?ová Z,vubová R, Kohanová J, et al. Silicon mitigates the Cd toxicity in maize in relation to cadmium translocation, cell distribution, antioxidant enzymes stimulation and enhanced endodermal apoplasmic barrier development[J]. Plant Growth Regulation,2013,70(1):89-103.

[18] Song A, Li Z, Zhang J, et al. Silicon-enhanced resistance to cadmium toxicity inBrassicachinensisL. is attributed to Si-suppressed cadmium uptake and transport and Si-enhanced antioxidant defense capacity[J]. Journal of Hazardous Materials,2009,172(1):74-83.

[19] Suhayda C G, Haug A. Organic acids reduce aluminum toxicity in maize root membranes[J]. Physiologia Plantarum,1986,68(2):189-195.

[20] Boominathan R, Doran P M. Organic acid complexation, heavy metal distribution and the effect of ATPase inhibition in hairy roots of hyperaccumulator plant species[J]. Journal of Biotechnology,2003,101(2):131-146.

[21] Kidd P S, Llugany M, Poschenrieder C H, et al. The role of root exudates in aluminium resistance and silicon-induced amelioration of aluminium toxicity in three varieties of maize (ZeamaysL.)[J]. Journal of Experimental Botany,2001,52(359):1339-1352.

TheEffectandMechanismofSilicononSorghumSeedlingsGrowthUnderCadmiumStress

LIU Peng1, YIN Li-na1,2, WANG Shi-wen1,2, DENG Xi-ping1,2

(1.StateKeyLaboratoryofSoilErosionandDrylandFarmingontheLoessPlateau,InstituteofSoilandWaterConservation,ChineseAcademyofSciencesandMinistryofWaterResources,Yangling,Shaanxi712100,China; 2.InstituteofSoilandWaterConservation,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Although the effects of silicon on cadmium resistance are wildly reported, the underlying mechanism is still unclear. In the present study, we investigated the effect and mechanism of silicon on sorghum seedling growth under cadmium stress. The result indicated silicon application alleviated cadmium-induced decrease in fresh weight and dry weight both of shoot and root. The result indicated that the anti-oxidant enzyme activity was not affected by silicon under control condition. However under cadmium stress, the CAT and POD activity were significantly increased by silicon. The SOD activity was not influenced by silicon. Corresponding to this result, MDA was decreased by silicon. The result indicated that 3 types of organic acids (OA) including oxalic acid, propanedioic acid and succinic acid were detected in leaf. All of them were increased by silicon under cadmium stress. In the root, 4 types of OA such as oxalic acid, malic acid, propanedioic acid and citric acid were detected. Oxalic acid and propanedioic acid contents were increased by silicon. Citric Acid content was not influenced by silicon. However, the malic acid was decreased by silicon. All of the results indicated that the enhancement of anti-oxidant enzyme activity and OA content involved in the silicon-induced sorghum seedlings cadmium resistance.

silicon; cadmium; anti-oxidant enzyme; organic acid

2014-05-16

：2014-07-04

國家自然科學(xué)基金(31101597);教育部高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(QN2012048)

劉朋(1983—),男,山東泰安市人,博士,主要研究方向為植物生理生態(tài)。E-mail:412315121@qq.com

鄧西平(1959—),男,陜西西安市人,博士,研究員,主要研究方向為植物生理生態(tài)。E-mail:dengxp@ms.iswc.ac.cn

Q945.78

：A

：1005-3409(2014)06-0329-05