趙春風(fēng)，刁曉平,*，謝嘉，曹佳，宋芹芹，鄭鵬飛，王?；?/p>

1. 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，?？?570228 2. 海南大學(xué)?？谑协h(huán)境毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 570228 3. 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，海口 570228

鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)對(duì)馬氏珠母貝(Pinctada martensi)血細(xì)胞免疫功能及氧化應(yīng)激效應(yīng)的影響

趙春風(fēng)1,2，刁曉平1,2,*，謝嘉2,3，曹佳1，宋芹芹1，鄭鵬飛1，王?；?

1. 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，?？?570228 2. 海南大學(xué)海口市環(huán)境毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 570228 3. 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，海口 570228

鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)是一種持久性的有機(jī)污染物(POPs)，具有潛在毒性、致癌性。選取馬氏珠母貝(Pinctada martensi)為研究對(duì)象，研究DEHP對(duì)其血淋巴細(xì)胞免疫功能和脂質(zhì)過(guò)氧化水平的影響。將成年馬氏珠母貝暴露于不同濃度(0.5、2.0、8.0、16.0 mg·L-1)的DEHP中，暴露14 d后測(cè)定血細(xì)胞數(shù)目(THC)、吞噬能力(phagocytic activity)、細(xì)胞膜穩(wěn)定性(cell membrane stability)、脂質(zhì)過(guò)氧化程度(LPO)和總谷胱甘肽含量(T-GSH)的變化。結(jié)果顯示，血細(xì)胞數(shù)目隨DEHP濃度的升高而降低，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，最低可見(jiàn)效應(yīng)濃度(LOEC)<0.5 mg·L-1。細(xì)胞膜穩(wěn)定性和吞噬活力均隨DEHP濃度的升高，呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，其LOEC值分別小于2和8 mg·L-1。細(xì)胞中丙二醛(MDA)含量隨染毒濃度增加逐漸升高，在8 mg·L-1濃度組達(dá)到最高值，之后降低，與之相應(yīng)的脂質(zhì)過(guò)氧化水平也呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，LOEC<2 mg·L-1。8 mg·L-1濃度組的總谷胱甘肽含量與對(duì)照組相比存在顯著差異性(p<0.05)，LOEC<8 mg·L-1。研究結(jié)果表明：DEHP染毒14 d對(duì)馬氏珠母貝血淋巴細(xì)胞免疫功能有明顯的影響，同時(shí)還會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激效應(yīng)，在所測(cè)試的指標(biāo)中，血細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)DEHP的脅迫最敏感(LOEC<0.5 mg·L-1)，細(xì)胞膜穩(wěn)定性和脂質(zhì)過(guò)氧化水平的敏感性次之(LOEC<2 mg·L-1)。

鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)；馬氏珠母貝；血淋巴細(xì)胞；免疫功能；氧化應(yīng)激

鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)(PAEs)，被廣泛用作增塑劑來(lái)提高多種塑料的柔軟性。其中，鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)因其價(jià)格低廉并具有穩(wěn)定性、流動(dòng)性、不易揮發(fā)等特點(diǎn)而被廣泛使用[1]。同時(shí)，DEHP是環(huán)境內(nèi)分泌干擾素[2]，具有生殖毒性和免疫毒性等，且長(zhǎng)期存在于環(huán)境中不易分解，因此中國(guó)環(huán)境檢測(cè)總站和美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局(USEPA)均將該類化合物列為優(yōu)先控制污染物[3-4]。

雙殼貝類已經(jīng)被廣泛用作環(huán)境標(biāo)記物載體來(lái)檢測(cè)海洋環(huán)境污染[5-6]。雙殼貝類多棲息于濱海或河口地區(qū)，移動(dòng)性差，活動(dòng)范圍很小，營(yíng)濾食性生活，代謝率低，對(duì)海洋有機(jī)污染物具有很強(qiáng)的生物富集作用[7-8]。因此，通過(guò)研究貝類機(jī)體的變化可以反映出近海岸帶生態(tài)環(huán)境的污染情況。國(guó)內(nèi)外研究DEHP對(duì)貝類的影響，多集中于DEHP的生殖毒性和胚胎毒性等方面，較少?gòu)拿庖叨拘苑矫骈_(kāi)展DEHP對(duì)貝類的影響研究。

本研究選擇海南常見(jiàn)經(jīng)濟(jì)貝類馬氏珠母貝為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，研究DEHP脅迫對(duì)其血細(xì)胞非特異性免疫系統(tǒng)和抗氧化能力的影響，通過(guò)免疫和氧化損傷指標(biāo)篩選出敏感的生物標(biāo)志物，用于指示海洋環(huán)境中DEHP的污染程度，探討其免疫毒性機(jī)理和氧化損傷機(jī)制，并為防治DEHP對(duì)海洋環(huán)境的污染提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用馬氏珠母貝(Pinctada maetensi)購(gòu)于海南省陵水縣毅珠貝類養(yǎng)殖場(chǎng)，貝齡為2 y，平均殼長(zhǎng)6～7 cm。實(shí)驗(yàn)用海水取自海南陵水黎安港無(wú)污染區(qū)域的自然海水，經(jīng)80目篩絹網(wǎng)過(guò)濾處理后待用。

1.2 儀器與試劑

儀器：VOSHIN96-IIL超聲波破碎儀(沃信儀器公司，中國(guó))；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar公司，美國(guó))，Model 680型酶標(biāo)儀(BIO-RAD公司，美國(guó))，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Olympus公司，日本)；恒溫水浴箱(北京醫(yī)療設(shè)備，中國(guó))，YX280B高壓蒸汽滅菌鍋(上海三申醫(yī)療器械有限公司，中國(guó))，PHS—3B精密pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司，中國(guó))，5702臺(tái)式冷凍低速離心機(jī)(Eppendorf公司，德國(guó))。

試劑：NaCl，CaCl2，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，MgSO4，醋酸鈣，甲醛，乙酸，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，乙醇，丙酮(均為分析純)購(gòu)自中國(guó)廣州化工集團(tuán)；牛血清蛋白，BioRad試劑，2-硝基苯甲酸((DTNB)，50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 三氯乙酸 (TCA)溶液，1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 硫代戊巴比妥酸(TBA)溶液，中性紅(NR)染料，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)均購(gòu)自日本TCI公司；DEHP(Sigma公司，美國(guó))為分析純。

磷酸鹽緩沖液(PBS, pH 7.2)的配制：8 g NaCl、2.0 g Na2HPO4、0.2 g KH2PO4和0.2 g KCl，用蒸餾水定容至1 L，必要時(shí)用1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH，高壓滅菌，常溫保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 染毒方法

將馬氏珠母貝清洗干凈后清除貝體表面附著物，在盛有新鮮海水(鹽度為32‰，pH值為8.3，溫度為28 ℃～33 ℃)的水槽中馴養(yǎng)3 d，連續(xù)通氣，每日投喂金藻并換水。馴養(yǎng)結(jié)束后，選取殼長(zhǎng)6～7 cm的健康個(gè)體進(jìn)行染毒。

將選好的貝分別養(yǎng)于50 cm×30 cm×40 cm的玻璃水槽中，每只水槽10 L水，放置12只馬氏珠母貝。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以丙酮作為助溶劑(體積百分比小于1%)，以海水配制成400、800、1 600、3 200 μg·mL-1的母液，然后取1 mL加入水槽中配成0.5、2、8、16 mg·L-1實(shí)驗(yàn)溶液，同時(shí)設(shè)置丙酮對(duì)照組。對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)處理組均設(shè)置3個(gè)平行。連續(xù)通氣，每天換水，分別在染毒后14 d取樣。

1.3.2 樣品的采集

每個(gè)平行組分別取3只貝，用1 mL一次性注射器從閉殼肌旁的血竇中抽取血細(xì)胞，合并裝于EP管中，用改良的Alsever溶液做抗凝劑抗凝，并用PBS緩沖液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×106cell·mL-1，-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

對(duì)馬氏珠母貝的血淋巴細(xì)胞進(jìn)行以下幾個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)：血細(xì)胞計(jì)數(shù)(total haemocyte count, THC)，蛋白質(zhì)的濃度(protein concentration)，細(xì)胞膜的穩(wěn)定性(cell membrane stability)，吞噬活性(phagocytosis)以及脂質(zhì)過(guò)氧(LPO)化水平。

1.4.1 血細(xì)胞計(jì)數(shù)

取血細(xì)胞樣品與甲醇鈣溶液(BFC，含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的NaCl，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的醋酸鈣，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的甲醛)以血細(xì)胞∶BFC=1∶4的比例進(jìn)行稀釋，并固定細(xì)胞。用25×16格細(xì)胞計(jì)數(shù)板在普通顯微鏡下(40×15倍)觀察中央計(jì)數(shù)區(qū)，計(jì)算血細(xì)胞數(shù)目。

1.4.2 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定

蛋白質(zhì)濃度用改良的考馬斯亮藍(lán)法[9]來(lái)測(cè)定。將樣品用生理鹽水(0.02 mol·L-1HEPES，0.4 mol·L-1NaCl，0.1 mol·L-1MgSO4，0.01 mol·L-1KCl，0.01 mol·L-1CaCl2；pH7.4)4倍稀釋，取5 μL加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)(0.2～1.0 mg·mL-1牛血清蛋白)組和陰性對(duì)照組(生理鹽水)；然后往樣品和對(duì)照組中加入200 μL稀釋后的BioRad試劑(蒸餾水6倍稀釋)。做3個(gè)重復(fù)。20 ℃反應(yīng)20 min，用酶標(biāo)儀在595 nm的波長(zhǎng)下測(cè)OD值。

1.4.3 細(xì)胞膜穩(wěn)定性的測(cè)定

采用改良的中性紅(NR)法檢測(cè)馬氏珠母貝血細(xì)胞穩(wěn)定性[10]。具體步驟：首先，將50 μL血細(xì)胞樣品加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，4 ℃培養(yǎng)45 min，然后用生理鹽水將未凝集的細(xì)胞洗去；加入200 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.004%的NR溶液，室溫下培養(yǎng)3 h，待吞噬后，將多余的NR染料用生理鹽水洗去；隨后加入200 μL的酸化乙醇進(jìn)行脫色。用酶標(biāo)儀在550 nm吸收波長(zhǎng)下，測(cè)定各孔OD值。

1.4.4 吞噬活性的測(cè)定

通過(guò)檢測(cè)血細(xì)胞對(duì)中性紅(NR)染色的酵母多糖的吞噬活力來(lái)測(cè)定吞噬活性。具體步驟：血細(xì)胞樣品在冰上解凍，接著取50 μL加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，4 ℃培養(yǎng)1 h，用生理鹽水洗去未凝集的細(xì)胞；然后加入50 μL已被NR染色的酵母多糖懸液(50×107mL-1)常溫下培養(yǎng)30 min；隨后將多余的酵母多糖顆粒用生理鹽水洗去，加入100 μL BFC固定細(xì)胞，再加100 μL的酸化乙醇進(jìn)行脫色。用酶標(biāo)儀在550 nm吸收波長(zhǎng)下，測(cè)定各孔OD值。

1.4.5 脂質(zhì)過(guò)氧化程度的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)采用改良的硫代巴比妥酸(TBARS)法[11]進(jìn)行檢測(cè)。具體步驟：血細(xì)胞樣品在冰上解凍，然后取40 μL加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入10 μL BHT(1 mmol·L-12,6-二叔丁基-4-甲基苯酚溶解在乙醇中)，以防止進(jìn)一步脂質(zhì)過(guò)氧化；隨后加入100 μL提取液(20 mmol·L-1Tris-chloride，0.15 mol·L-1KCl，0.5 mol·L-1蔗糖，1 mmol·L-1乙二胺四乙酸；pH 7.6)，緊接著加入50 μL 50%的TCA溶液和75 μL 1%的TBA溶液；60 ℃水浴60 min后冰上降溫，用酶標(biāo)儀在550 nm吸收波長(zhǎng)下，測(cè)定各孔OD值，結(jié)果用丙二醛(MDAe)含量表示。

1.4.6 總谷胱甘肽(T-GSH)含量的測(cè)定

采用DTNB法測(cè)定總谷胱甘肽(GSH+GSSG)的含量[12]。取血細(xì)胞樣品200 mL，4 ℃離心5 min后棄掉上清，剩下的細(xì)胞用生理鹽水重懸。采用超聲波破碎儀將細(xì)胞破碎，-80 ℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)，將樣品置于冰上解凍，接著用移液器吸取80 μL樣品與40 μL DTNB溶液(10 mmol·L-1DTNB，100 mmol·L-1KH2PO4，5 mmol·L-1乙二胺四乙酸)混合，用DTNB對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。然后取40 μL被DTNB處理過(guò)的樣品加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后往樣品中加入210 μL谷胱甘肽還原酶液(2.06 U·mL-1谷胱甘肽還原酶，100 mmol·L-1KH2PO4，5 mmol·L-1乙二胺四乙酸；pH 7.5)。平衡1 min，然后加入60 μL 1 mmol·L-1乳醛還原酶(NADPH)溶液，反應(yīng)1 min。用酶標(biāo)儀在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品的OD值。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)組作6次重復(fù)，結(jié)果以Mean±SEM表示，并用采用SPSS Statistics17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比較(Duncan)，其中獨(dú)立樣本數(shù)n=3，對(duì)各濃度組與對(duì)照組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性顯著分析。

2 結(jié)果(Results)

2.1 鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)對(duì)血細(xì)胞數(shù)量的影響

如圖1所示，隨染毒濃度的增加，馬氏珠母貝血細(xì)胞數(shù)量呈遞減趨勢(shì)，呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，其最低可見(jiàn)效應(yīng)濃度(LOEC) <0.5 mg·L-1，即從0.5 mg·L-1濃度組血細(xì)胞數(shù)量(5.02×106cell·mL-1)與對(duì)照組(8.77×106cell·mL-1)相比，存在顯著差異(p<0.05)；8 mg·L-1濃度組的血細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比呈極顯著差異(p<0.01)；16 mg·L-1濃度組血細(xì)胞數(shù)量最少為1.25×106cell·mL-1，與對(duì)照組相比，減少了86%。

2.2 鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)對(duì)血細(xì)胞膜穩(wěn)定性的影響

如圖2所示，血細(xì)胞膜的穩(wěn)定性隨DEHP暴露濃度的升高出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)染毒濃度為2.0 mg·L-1時(shí)，細(xì)胞膜穩(wěn)定性最高，其OD550達(dá)到4.16 mg-1prot，與對(duì)照組(3.61 mg-1prot)相比出現(xiàn)顯著性差異(p<0.05)。然后隨著染毒濃度的增高，OD550值逐漸降低，到染毒濃度達(dá)16.0 mg·L-1時(shí)降至最低，與對(duì)照組水平，降幅達(dá)到54%，但與對(duì)照組相比，并沒(méi)有表現(xiàn)顯著差異性(p>0.05)。

2.3 鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)對(duì)血細(xì)胞細(xì)胞吞噬活力的影響

從圖3中可以看出，起初隨著DEHP濃度的增加，細(xì)胞吞噬活性也隨之增強(qiáng)，當(dāng)染毒濃度達(dá)到8.0 mg·L-1時(shí)，與對(duì)照組相比，出現(xiàn)顯著性差異(p<0.05)，細(xì)胞吞噬酵母聚糖顆粒的OD550值為3.21 mg-1prot，LOEC<8.0 mg·L-1。當(dāng)濃度達(dá)到16.0 mg·L-1時(shí)，吞噬作用有減弱，與對(duì)照組相比，無(wú)顯著性差異(p>0.05)。

2.4 DEHP對(duì)血細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化水平的影響

DEHP對(duì)馬氏珠母貝血細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化水平的影響如圖4所示。隨DEHP濃度的升高，細(xì)胞中MDA含量隨之逐漸升高。當(dāng)染毒濃度達(dá)到2.0 mg·L-1時(shí)，細(xì)胞中MDA含量與對(duì)照組相比，存在顯著差異性(p<0.05)，其LOEC<2.0 mg·L-1。染毒濃度達(dá)到8 mg·L-1時(shí)，MDA含量最高。當(dāng)染毒濃度為最高值(16 mg·L-1)時(shí)，MDA含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(p>0.05)。

圖1 鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)染毒14 d 對(duì)馬氏珠母貝血細(xì)胞數(shù)量(THC)的影響注：* p<0.05，** p<0.01，與對(duì)照相比，下同。Fig. 1 Total haemocyte counts (THC) of Pinctada martensi after exposure to diethylhexyl phthalate (DEHP) for 14 dNote: * p<0.05, ** p<0.01, compared with the control, the same below.

圖2 鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)染毒14 d對(duì) 馬氏珠母貝血細(xì)胞膜穩(wěn)定性的影響Fig. 2 Haemocyte membrane stability of Pinctada martensi after exposure to DEHP for 14 d

圖3 鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)染毒14 d對(duì) 馬氏珠母貝血細(xì)胞吞噬活力的影響Fig. 3 Phagocytic activity of haemocyte of Pinctada martensi after exposure to DEHP for 14 d

圖4 鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)DEHP染毒14 d對(duì) 馬氏珠母貝血細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化水平(LPO)的影響Fig. 4 Lipid peroxidation (LPO) of Pinctada martensi after exposure to DEHP for 14 d

2.5 鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)對(duì)血細(xì)胞總谷胱甘肽(T-GSH)含量的影響

DEHP脅迫誘導(dǎo)血細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激效應(yīng)的結(jié)果見(jiàn)圖5。起初隨染毒濃度的升高，血細(xì)胞的總谷胱甘肽(T-GSH)含量呈逐漸遞增的趨勢(shì)，其中8 mg·L-1濃度組含量最高，為16.04 nmol·mg-1prot，與對(duì)照組(11.30 nmol·mg-1prot)相比，有明顯差異(p <0.05)，LOEC<8 mg·L-1。當(dāng)染毒濃度為最高值(16 mg·L-1)時(shí)，T-GSH含量明顯下降，但與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異(p >0.05)。

3 討論(Discussion)

DEHP來(lái)源主要通過(guò)3個(gè)途徑[13]：含有該物質(zhì)的廢水的直接排放，固體廢棄物緩慢釋放經(jīng)雨水淋溶后，進(jìn)入地下水和地表水；間接途徑是首先進(jìn)入大氣，經(jīng)沉降或雨水進(jìn)入水環(huán)境中；另外，還有垃圾及其滲透液。進(jìn)入水環(huán)境的DEHP會(huì)通過(guò)江河匯流及地下水滲透，最終進(jìn)入海洋生態(tài)系統(tǒng)，從而對(duì)近海岸生態(tài)系統(tǒng)造成極大的影響[14]。有關(guān)研究報(bào)道DEHP具有生殖毒性、胚胎發(fā)育毒性、遺傳毒性、免疫毒性和神經(jīng)毒性[15]。

本實(shí)驗(yàn)研究了DEHP對(duì)馬氏珠母貝免疫功能的影響。血細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中，隨著染毒濃度的升高，血細(xì)胞數(shù)目也隨之減少，與對(duì)照組相比，0.5、2.0、8.0和16.0 mg·L-1這4個(gè)濃度組的血細(xì)胞數(shù)目分別減少了43%、52%、67%和86%。血細(xì)胞參與機(jī)體的各種反應(yīng)，包括氣體交換，滲透調(diào)節(jié)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和分配，代謝廢物的排泄以及損傷修復(fù)等，在貝類的先天免疫機(jī)制中起到至關(guān)重要的作用[16-17]。所以，血細(xì)胞數(shù)量的下降，可能是由于DEHP抑制了血細(xì)胞的產(chǎn)生或減少了其在組織中的釋放，從而導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的功能減弱。解瑋等[18]研究DEHP內(nèi)分泌干擾活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，DEHP可升高乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)的雌激素受體(ERs)水平，得出了一定劑量水平的DEHP具有雌激素活性的結(jié)論。有研究表明17β-雌二醇以劑量依賴方式誘導(dǎo)Jurkat淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡[19]。張修武等[20]也發(fā)現(xiàn)雌二醇能夠誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞發(fā)生典型細(xì)胞凋亡。本研究也得到了相似的結(jié)果，即馬氏珠母貝的血細(xì)胞數(shù)量隨DEHP染毒濃度升高逐漸減少，存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，其中LOEC<0.5 mg·L-1。馬氏珠母貝血細(xì)胞數(shù)量對(duì)DEHP的毒性脅迫有著明顯的響應(yīng)?？梢酝茰y(cè)出無(wú)脊椎動(dòng)物的非特異性免疫細(xì)胞在DEHP脅迫下，與雌激素刺激脊椎動(dòng)物所產(chǎn)生的影響相似。其作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

圖5 鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)染毒14 d對(duì) 馬氏珠母貝血細(xì)胞總谷胱甘肽(T-GSH)含量的影響Fig. 5 Total glutathione concentration (T-GSH) of Pinctada martensi after exposure to DEHP for 14 d

對(duì)外源物質(zhì)的吞噬作用主要通過(guò)膜的變形功能得以實(shí)現(xiàn)，而細(xì)胞膜的穩(wěn)定性改變，會(huì)影響膜的變形功能，進(jìn)而使吞噬活力改變。本研究中的吞噬活力和細(xì)胞膜穩(wěn)定性變化趨勢(shì)相同，在一定濃度范圍內(nèi)，活性增強(qiáng)，而當(dāng)濃度達(dá)到較高時(shí)，活力下降。貝類中存在類IL-1α、IL-1β、IL-2樣細(xì)胞因子，且其功能與高等動(dòng)物的相似[21]。低濃度的DEHP脅迫，可促進(jìn)IL-1β的分泌，進(jìn)而激活炎癥反應(yīng)[22]，吞噬活力隨之增強(qiáng)。當(dāng)高濃度的DEHP脅迫時(shí)，脂溶性污染物DEHP能夠與細(xì)胞膜結(jié)合，改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性和細(xì)胞膜上離子泵，導(dǎo)致細(xì)胞膜穩(wěn)定性降低，并且能夠阻礙血細(xì)胞變形運(yùn)動(dòng)，降低其吞噬活性[23-24]。Watanuki等報(bào)道了DEHP對(duì)鯉魚(yú)前腎白細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)中劑量濃度組(10和100 nmol·L-1)能使細(xì)胞的吞噬活力增強(qiáng)，而高濃度的DEHP(1 000 nmol·L-1)能引起吞噬活力下降[25]。筆者的研究也得到類似的結(jié)果。而在本研究中，血細(xì)胞數(shù)減少與吞噬活性增強(qiáng)同時(shí)發(fā)生。這一點(diǎn)與雌二醇對(duì)免疫系統(tǒng)的影響的研究結(jié)果相似。如袁文丹等[26]發(fā)現(xiàn)雌二醇有免疫增強(qiáng)和免疫抑制的雙重功效，隨時(shí)間、劑量的大小而變化，在較高劑量雌激素可引起腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能抑制，在低劑量時(shí)，雌激素可增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力。因此可以推測(cè)DEHP也通過(guò)類似的途徑作用于貝血細(xì)胞，導(dǎo)致血細(xì)胞數(shù)減少和吞噬功能增強(qiáng)同時(shí)存在。

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的主要產(chǎn)物之一，其含量的高低可指示生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，目前已較多地應(yīng)用于水生生態(tài)毒理學(xué)研究。DEHP在體內(nèi)代謝迅速降解為其單酯形式(MEHP)和其他產(chǎn)物，并產(chǎn)生了引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化的自由基，這些自由基攻擊生物膜使氧化速率加快，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化作用的發(fā)生，產(chǎn)生MDA等一系列對(duì)機(jī)體有害的產(chǎn)物。紀(jì)靚靚等[27]也發(fā)現(xiàn)污染物能促進(jìn)自由基的產(chǎn)生，使抗氧化酶活性改變，MDA含量極顯著升高。本研究也獲得相似的結(jié)果，在DEHP脅迫下，血細(xì)胞中MDA含量隨濃度增加而上升，達(dá)到最高濃度時(shí)略有下降。血細(xì)胞中LPO水平的升高，表明DEHP脅迫使貝體內(nèi)氧自由基迅速增加，抗氧化防御體系僅能清除出部分自由基，從而緩解其對(duì)貝類造成的部分損傷，余下未能及時(shí)清除的自由基對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了不可逆轉(zhuǎn)的損害，導(dǎo)致機(jī)體LPO水平升高。

谷胱甘肽(GSH)是機(jī)體的主要抗氧化劑之一，GSH分子中的巰基(-SH)能中和活性氧自由基，在谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)的作用下將過(guò)氧化氫(H2O2)還原成H2O。當(dāng)貝類受到DEHP脅迫時(shí)，貝體中發(fā)生代謝反應(yīng)產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，引發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為隨著DEHP濃度的增加，T-GSH含量出現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，這與李麗萍等[28]研究DEHP誘導(dǎo)大鼠睪丸能量代謝酶的結(jié)果相似。本研究結(jié)果表明谷胱甘肽合成對(duì)DEHP誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧自由基有積極的抵抗作用，從而有助于增強(qiáng)貝體對(duì)DEHP毒害效應(yīng)的抵御能力。綜上所述，DEHP污染會(huì)導(dǎo)致馬氏珠母貝免疫功能發(fā)生變化并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激效應(yīng)。

DEHP脅迫會(huì)破壞馬氏珠母貝體內(nèi)的氧化平衡狀態(tài)并使貝體的免疫功能發(fā)生變化。馬氏珠母貝血細(xì)胞的數(shù)量對(duì)DEHP的脅迫最敏感，并呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，LOEC<0.5 mg·L-1；DEHP的脅迫對(duì)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和血細(xì)胞的吞噬活性也有一定的影響，前者比后者更加敏感。DEHP污染還會(huì)誘導(dǎo)馬氏珠母貝產(chǎn)生氧化應(yīng)激效應(yīng)，表現(xiàn)為貝體內(nèi)總GSH以及MDA含量出現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。研究結(jié)果表明：監(jiān)測(cè)DEHP對(duì)貝類血細(xì)胞免疫系統(tǒng)的變化及氧化損傷情況，可以作為生物指示物用于指示海洋中DEHP的污染程度，并為毒理機(jī)制研究提供依據(jù)。

[1] Staples C A, Peterson D R, Parkerton T F, et al. The environmental fate of phthalate esters: A literature review [J]. Chemosphere, 1997, 35(4): 667-749

[2] Jobling S, Reynolds T, White R, et a1. A variety of environmentally persistent chemicals, including some phthalate plasticizers, are weakly estrogenic [J]. Environmental Health Perspectives, 1995, 103(7): 582-587

[3] 金相燦. 有機(jī)化合物污染化學(xué)-有毒有機(jī)物污染化學(xué)[M]. 北京: 清華大學(xué)出版社, 1990: 266-275

[4] US Environmental Protection Agency. National Primary Drinking Water Regulations, Federal Register, 40 CFR Chapter I, Part 141 [S]. Washington DC: US Environmental Protection Agency, 1991

[5] Soto M, Marigomez I. Metal bioavailability assessment in Mussel-Watch programmes by automated image analysis of BSD in digestive cell lysosomes [J]. Marine Ecology Progress Series, 1997, 156: 141-150

[6] Orbea A, Garmendia L, Marigomez I, et al. Effects of the 'Prestige' oil spill on cellular biomarkers in intertidal mussels: Results of the first year of studies [J]. Marine Ecology Progress Series, 2006, 306: 177-189

[7] Cajaraville M P, Bebianno M J, Blasco J, et al. The use of biomarkers to assess the impact of pollution in coastal environments of the Iberian Peninsula: A practical approach [J]. Science of Total Environment, 2000, 247(2-3): 295-311

[8] 潘魯清, 劉娜, 王靜. 櫛孔扇貝在B[a]P脅迫下生物標(biāo)志物篩選的研究[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2012, 36(2): 299-306

Pan L Q, Liu N, Wang J. Study of biomarkers selection of the scallop Chlamys farreri exposed to B[A]P [J]. Acta Hydrobiolgica Sinica, 2012, 36(2): 299-306 (in Chinese)

[9] Bradford M. A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding [J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72(1-2): 248-254

[10] Hannam M L, Bamber S D, Sundt R C, et al. Immune modulation in the blue mussel Mytilus edulis exposed to North Sea produced water [J]. Environmental Pollution, 2009, 157(6): 1939-1944

[11] Camejo G, Wallin B, Enojarvi M. Free Radical and Antioxidant Protocols-Analysis of Oxidation and Antioxidants Using Microtiter plates [M]. Methods in Molecular Biology, 1998: 377-387

[12] Owens C W I, Belcher R V. A colorimetric micro-method for the determination of glutathione [J]. Biochemical Journal, 1965, 94(3): 705-711

[13] 胡雄星, 韓中豪, 劉必寅, 等. 鄰苯二甲酸酯的毒性及其在環(huán)境中的分布[J]. 環(huán)境科學(xué)與管理, 2007, 32(1): 37-40

Hu X X, Han Z H, Liu B Y, et al. Distrubution of phthalic acid esters in environment and its toxicity [J]. Environmental Science and Management, 2007, 32(1): 37-40 (in Chinese)

[14] Deutschle T, Reiter R, Butte W, et al. A controlled challenge study on di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) in house dust and the immune response in human nasal muscosa of allergic subjects [J]. Environmental Health Perspectives, 2008, 116(11): 1487-1494

[15] 高峰, 張琨, 吳曉剛, 等. 鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯毒性作用[J]. 職業(yè)與健康, 2011, 27(17): 2019-2020

Gao F, Zhang K, Wu X G, et al. Study on toxicity of di-(2-ethylhexyl) phthalate [J]. Occupation and Health, 2011, 27(17): 2019-2020 (in Chinese)

[16] Cheng T C, Bivalves R. Invertebrate Blood Cells [M]. London: Academic Press, 1981: 233-300

[17] Shumway E S, Parsons J G. Scallops: Biology, Ecology and Aquaculture [M]. Amsterdam: Elsevier, 2006,: 123-227

[18] 解瑋. 某市供水體系有機(jī)提取物內(nèi)分泌干擾活性與鄰苯二甲酸二乙基己酯性激素干擾效應(yīng)研究[D]. 上海: 復(fù)旦大學(xué), 2004: 50-61

Xie W. Study on the endocrine disrupting effects of organic extracts from drinking water in a Chinese city and sex hormone disrupting effects caused by di(2-ethylhexyl)phthalate [D]. ShangHai: Fudan University, 2004: 50-61 (in Chinese)

[19] Jenkins J K, Suwarmaroj S, Elbourne K B, et a1. 17-β-Estradiol alters Jurkat lymphocyte cell cycling and induces apoptosis through suppression of Bcl-2 and cyclin A [J]. International Immunopharmacology, 2001, 1(11): 1897-1911

[20] 張修武, 牛喜林, 郭兆貴. 雌二醇誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞程序性死亡[J]. 免疫學(xué)雜志, 1997, 13(1): 14-16

Zhang X W, Niu X L, Guo Z G. Estradiol induces apoptosis in mouse peritoneal macrophages [J]. Immunological Journal, 1997, 13(1): 14-16 (in Chinese)

[21] Enzo O, Antonella F, Stefano C. Cytokines and invertebrate immune responses [J]. Biology Cell, 1995, 85(1): 87-91

[22] 王佳, 孫霞, 董四君. 鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)對(duì)THP-1細(xì)胞IL-1β和MMP-8表達(dá)及ROS的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2013, 8(3): 350-356

Wang J, Sun X, Dong S J. Effects of DEHP on expression of IL-1β and MMP-8 and ROS production in THP-1 cells [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2013, 8(3): 350-356 (in Chinese)

[23] Grundy M M, Moore M N, Howell S M, et al. Phagocytic reduction and effects on lysosomal membranes by polycyclic aromatic hydrocarbons, in haemocytes of Mytilus edulis [J]. Aquatic Toxicology, 1996, 34(4): 273-290

[24] Camus L, Jones M B, Borseth J F, et al. Total oxyradical scavenging capacity and cell membrane stability of haemocytes of the Arctic scallop, Chlamys islandicus, following benzo (a) pyrene exposure [J]. Marine Environmental Research, 2002, 54(3): 425-430

[25] Hironobu W, Yoshiki G, Masahiro S. In vitro modulation of common carp (Cyprinus carpio L.) phagocytic cells by di-n-butyl phthalate and di-2-ethylhexyl phthalate [J]. Aquatic Toxicology, 2003, 63(2): 119-126

[26] 袁文丹, 崔勇, 劉巍, 等. 17β一雌二醇對(duì)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞免疫活性影響[J]. 濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2007, 30(4): 296-298

Yuan W D, Cui Y, Liu W, et al. Effects of 17β-estradiol on immunocompetence of peritoneal macrophages of rat in vitro [J]. Journal of Jining Medical College, 2007, 30(4): 296-298 (in Chinese)

[27] 紀(jì)靚靚, 李法云, 羅義, 等. 2,4,6-三氯苯酚誘導(dǎo)鯽魚(yú)肝臟自由基的產(chǎn)生及其氧化應(yīng)激[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2007, 18(1): 129-132

Ji L L, Li F Y, Luo Y, et al. Free radicals in Carassius auratus liver: Their generation and oxidative stress induced by 2,4,6-trichlorophenol [J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2007, 18(1): 129-132 (in Chinese)

[28] 李麗萍, 劉秀芳, 寧艷花, 等. DEHP對(duì)大鼠睪丸能量代謝酶的影響及其氧化損傷作用[J]. 寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 32(1): 74-77

Li L P, Liu X F, Ning Y H, et al. Effects of DEHP on rat testicular enzymes of energy metabolism and its role in oxidative damage [J]. Journal of Ningxia Medical University, 2010, 32(1): 74-77 (in Chinese)

◆

EffectsofDiethylhexylPhthalateonHaemocyteImmuneFunctionsandOxidativeStressinPinctadamartensi

Zhao Chunfeng1,2, Diao Xiaoping1,2,*, Xie Jia2,3, Cao Jia1, Song Qinqin1, Zheng Pengfei1, Wang Haihua1

1. College of Agriculture, Hainan University, Haikou 570228, China 2. Haikou Key Laboratory of Environment Toxicology, Hainan University, Haikou 570228, China 3. College of Environment and Plant Protection, Hainan University, Haikou 570228, China

12 November 2013accepted15 January 2014

Diethylhexyl phthalate (DEHP) is one of persistent organic pollutants (POPs), and poses a significant risk for carcinogenicity, teratogenicity and mutagenicity. In this study, changes of total haemocyte counts (THC), cell membrane stability, phagocytic activity and oxidative stress parameters, including lipid peroxidation (LPO) and total glutathione (T-GSH), of haemocytes of Pinctada martensi were measured in the haemolymph after exposure to different concentrations of DEHP (0.5, 2, 8 mg·L-1) for 14 days. The results showed that THC decreased while DEHP concentrations increased, showing an apparent negative dose-response curve. The lowest-observed-effect concentration (LOEC) for THC decrease was lower than 0.5 mg·L-1. Besides, cell membrane stability, phagocytic activity and lipid peroxidation level were reduced after a short-time rise with increasing DEHP concentration, showing an inverted U-shaped curve with LOEC value <2 mg·L-1, <8 mg·L-1and <2 mg·L-1, respectively. The T-GSH content in 8 mg·L-1group showed significant difference compared with the control group (p<0.05), with LOEC value <8 mg·L-1. It is indicated that 14 d-exposure to DEHP had significantly negative effect on the immune functions of haemocytes, and could induce oxidative stress in Pinctada martensii. The THC was the most sensitive indicator to the exposure of DEHP, followed by cell membrane stability and lipid peroxidation level.

diethylhexyl phthalate; Pinctada martensi; haemocyte; immune function; oxidative stress

海南省科技興海項(xiàng)目(XH201309);海南省研究生創(chuàng)新科研課題(Hys2012-1)

趙春風(fēng)(1989-)，男，碩士，研究方向?yàn)樯鷳B(tài)毒理學(xué)，E-mail: zhao.c.f-2008@163.com

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: diaoxip@hainu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20130722002

趙春風(fēng)，刁曉平，謝嘉，等. 鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)對(duì)馬氏珠母貝(Pinctada martensi)血淋巴細(xì)胞的免疫功能及氧化應(yīng)激效應(yīng)的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2014, 9(2): 375-381

Zhao C F, Diao X P, Xie J, et al. Effects of diethylhexyl phthalate on haemocyte immune functions and oxidative stress in Pinctada martensi [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(2): 375-381 (in Chinese)

2013-11-12錄用日期2014-01-15

1673-5897(2014)2-375-07

X171.5

A

刁曉平(1963—)，女，生態(tài)學(xué)博士，教授，主要研究方向?yàn)樯鷳B(tài)毒理學(xué)和污染生態(tài)學(xué)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文30余篇。