黃 欣，胡 英△，王秀娟，金麗艷，張雙元

（1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗診斷教研室，西寧 810001；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院乳甲外科，西寧 810001）

Fas基因?qū)儆谀[瘤壞死因子受體超家族成員［1］，是調(diào)控細胞凋亡的重要因子之一，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切［2］。Fas基因啟動子區(qū)670位點位于核轉(zhuǎn)錄元件GAS的結(jié)合位點（ATTCCAGAAA）［3］，在該位點發(fā)生 GA→GG的替換，可破壞轉(zhuǎn)錄因子STAT1的結(jié)合位點，影響Fas基因的表達，從而使死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路失調(diào)而致細胞癌變［4］。在全球范圍內(nèi)乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一［5－6］。本研究探討凋亡基因Fas－670的基因多態(tài)性與乳腺癌臨床病理指標的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010年1月至2012年11月青海大學(xué)附屬醫(yī)院收治的330例女性乳腺癌（均經(jīng)組織病理學(xué)確診）患者術(shù)前外周血5mL?；颊咝g(shù)前均未經(jīng)化、放療。由于考慮到基因可能具有種族差異性剔除了非漢族患者資料，并剔除病理資料不全的患者資料后實際納入研究232例?；颊吣挲g26～83歲，中位年齡47歲。TNM分期Ⅰ期14例，Ⅱ期128例，Ⅲ期62例，Ⅳ期9例，分期不明19例。

1.2 方法 采集乳腺癌患者術(shù)前肘靜脈抗凝血標本（EDTANa2抗凝）5mL，用血液基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）提取外周血DNA，用聚合酶鏈反應(yīng)－限制性片段長度多態(tài)性（PCR－RFLP）方法檢測Fas－670（rs1800682）基因型。引物序列參照文獻［6］由上海捷瑞生物工程有限公司合成。上游引物5′－ATA GCT GGG GCT ATG CGA TT－3′，下游引物5′－CAT TTG ACT GGG CTG TCC AT－3′。PCR反應(yīng)體系25μL，含100ng模板DNA，10μmol／L上、下游引物各1 μL，12.5μL 2×Taq PCR Master Mix（天根生化科技北京有限公司），加ddH2O至25μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，退火溫度為57℃，72℃延伸30s，共30個循環(huán)后，72℃最終延伸10min。PCR產(chǎn)物片段大小為193bp；20 μL PCR產(chǎn)物用限制性核酸內(nèi)切酶ScrFⅠ（紐英倫生物技術(shù)北京有限公司）于37℃孵育2h以上，酶切產(chǎn)物于2.5%瓊脂糖凝膠（溴化乙錠染色）電泳（70V，60min），利用凝膠成像系統(tǒng)觀察基因型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。以χ2檢驗分析Fas－670與青海地區(qū)乳腺癌臨床指標的關(guān)系。檢驗方法均為雙側(cè)檢驗，檢驗水準α＝0.05。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基因型分析 Fas－670純合野生型AA產(chǎn)生1個193bp片段，純合突變型GG有1個ScrFⅠ酶切位點，產(chǎn)生136bp和57bp兩個片段，雜合型AG產(chǎn)生193、136和57bp 3個片段。見圖1。

圖1 PCR－RFLP檢測FAS－670基因多態(tài)性

2.2 基因型分布 232例乳腺癌中，F(xiàn)as－670基因多態(tài)頻率分布：純合野生型AA為39.7%（92／232）、雜合型AG為48.7%（113／232）、純合突變型 GG 為11.6%（27／232）。其 Fas－670基因多態(tài)分布的頻率分布符合群體遺傳學(xué)Hardy－Weinberg平衡定律（χ2＝0.757，P＝0.384）。

2.3 Fas－670基因型與青海乳腺癌臨床指標的關(guān)系 見表1。

表1 Fas－670基因型與青海地區(qū)乳腺癌臨床指標的關(guān)系［n（%）］

3 討 論

細胞增殖與細胞凋亡之間的不平衡是腫瘤形成的基礎(chǔ)，F(xiàn)as基因是調(diào)控細胞凋亡的重要因子之一。FasL與細胞表面的Fas結(jié)合，即可誘導(dǎo)靶細胞凋亡，而Fas／FasL介導(dǎo)的腫瘤細胞免疫逃逸機制有：（1）腫瘤細胞表達FasL，促進Fas高表達激活的T細胞凋亡，使腫瘤細胞產(chǎn)生免疫逃逸［7］，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、肺癌、肝癌、胃腸道腫瘤等多種腫瘤細胞高表達FasL。在機體抗腫瘤免疫應(yīng)答時，活化的腫瘤特異性T細胞Fas表達增多［8］。（2）腫瘤細胞表面Fas表達缺失或下降，使腫瘤細胞凋亡受阻［9］，有研究表明乳腺癌Fas表達丟失和FasL過表達不僅參與了腫瘤的免疫逃逸和免疫耐受，還與腫瘤的浸潤密切相關(guān)［10］。（3）凋亡抑制基因（如Bcl－2等）出現(xiàn)高表達［11］。

Fas基因啟動區(qū)存在的Fas－670多態(tài)位點由于影響Fas基因表達，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中顯得尤為重要。本研究主要探討凋亡基因Fas－670基因多態(tài)性與青海地區(qū)乳腺癌臨床病理指標的關(guān)系。

國內(nèi)張柏林等［12］對840例乳腺癌患者和840例健康人進行病例對照研究 Fas（－1377G／A 和－670A／G）和 FasL基因（－844T／C和7896G／C）基因多態(tài)性對乳腺癌發(fā)病風(fēng)險的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：攜帶Fas－1377A／－670A單體型者乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險高 于 攜 帶 Fas－1377G／－670A 單 體 型 者，但 是 攜 帶 Fas－1377G／－670G單體型者乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險則低于Fas－1377G／－670A單體型攜帶者，提示Fas－FasL系統(tǒng)的功能性遺傳多態(tài)性可能與乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險增加有關(guān)。Hashemi等［13］對伊朗134例乳腺癌患者和152例健康女性進行Fas－1377G／A（rs2234767）和－670A／G（rs1800682）基因多態(tài)性和乳腺癌的聯(lián)系的研究，發(fā)現(xiàn)Fas－1377G／A（rs2234767）基因多態(tài)分布在這兩組間并無顯著不同，而Fas－670A／G（rs1800682）基因多態(tài)性與乳腺癌的風(fēng)險有顯著聯(lián)系（P＝0.019）。

由于Fas基因多態(tài)性與腫瘤發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系存有爭議，Zhang等［14］以34個已發(fā)表的病例對照研究為基礎(chǔ)，對11 461例癌癥患者和12 708例健康對照組用Meta法分析Fas兩個基因多態(tài)性與腫瘤發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系，結(jié)果顯示：Fas－1377AA基因型比－1377GG或GA／GG基因型有較高的腫瘤發(fā)病風(fēng)險，而Fas－670GG基因型無影響。Knechtel等［15］對216例淋巴結(jié)陽性的乳腺癌婦女檢測包括Fas－1377和Fas－670的16例基因多態(tài)性的影響，單因素分析發(fā)現(xiàn)Fas－1377基因多態(tài)性與無病生存率和總生存率顯著相關(guān)，而Fas－670基因多態(tài)卻與無病生存率和總生存率無關(guān)聯(lián)。Crew等［16］在美國紐約研究1 053例乳癌患者和1 102例健康人Fas和FasL基因多態(tài)性與乳腺癌風(fēng)險的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as－1377G／A、Fas－670G／A和 FasL－844C／T基因多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險無顯著聯(lián)系，也沒有數(shù)據(jù)顯示基因多態(tài)性與年齡和雌激素水平等相關(guān)。本研究結(jié)果也未發(fā)現(xiàn)Fas－670基因多態(tài)性與青海地區(qū)女性乳腺癌患者的臨床分期及腫瘤大小等臨床病理指標有聯(lián)系。

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