孫化鵬，張 珉，曹雄軍，鐘曉紅

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙410128；2.湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長沙410004）

柿（Diospyroskaki Thunb）為柿樹科柿屬植物，是重要的經(jīng)濟(jì)樹種[1]，其果實具有較高的營養(yǎng)價值，其葉片也有很好的藥用功效[2-3]。柿樹葉片入藥最早記載于《滇南本草》，隨后在諸家本草及醫(yī)（藥）書中也多有記載[4]。隨著現(xiàn)代提取分離技術(shù)以及波譜學(xué)、藥理學(xué)的發(fā)展，國內(nèi)外研究人員對柿樹葉片化學(xué)成分進(jìn)行深入研究，分離鑒定出金絲桃苷、山萘酚葡萄糖苷、山萘酚木糖苷、山萘酚鼠李糖苷、山萘酚阿拉伯糖苷等多種黃酮類化合物[5-8]，并結(jié)合藥理活性試驗證明了這些化合物在止血、抗氧化、抑菌消炎、防癌抗癌、抗過敏等方面的藥用功能，是柿樹葉片的主要功效成分[9-11]。

采收黃酮類化合物含量高的柿樹葉片原料，是炮制高質(zhì)量柿樹葉片藥材的基礎(chǔ)。但柿樹葉片黃酮類化合物是次生代謝產(chǎn)物，其在柿樹葉片中的含量積累隨著生長周期的變化而變化，且不同品種柿樹葉片中的含量也有所差異。為獲得高質(zhì)量的柿樹葉片藥材原料，優(yōu)選高黃酮含量的品種資源以及確定適宜的采收時期，試驗以湖南省長沙市牛心柿樹葉片為試材，通過建立一種穩(wěn)定、可靠、重現(xiàn)性好的柿樹葉片黃酮類化合物高效液相色譜（HPLC）分析檢測方法，對不同生長時期柿樹葉片中黃酮類化合物進(jìn)行比較分析，探討柿樹葉片黃酮類化合物的代謝累積規(guī)律，并檢測分析了湖南省不同地區(qū)、不同品種柿樹葉片中黃酮類化合物的含量[12]，以期為選擇合理適宜的柿樹葉片采收時期和優(yōu)選高含量的柿樹葉片品種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以2010年采集的湖南省7個地區(qū)17個不同品種柿樹新鮮葉片為材料，具體采樣地點見表1。將采集的柿樹葉片洗凈后置于60℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重，粉碎后密封備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品溶液的制備 稱取干燥柿樹葉片粉末1.0 g，用60%乙醇溶液超聲輔助提取后定容至100m L，超聲脫氣后過0.45μm微孔濾膜，即為待測樣品溶液。

1.2.2 HPLC檢測條件 試驗采用島津LC10高效液相色譜（SPD-20A檢測器）進(jìn)行檢測。色譜條件如下：色譜柱為C18柱（φ4.6mm×150 nm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）；二元高壓梯度洗脫：0～30min，15%A；30～60min，15%～20%A；60～70min,20%～30%A；70～85min，30%A；85～90min，30%～80%A；檢測波長360nm；流速1m L/min；進(jìn)樣量20μL；柱溫30℃。

1.2.3 檢測方法的精密度及樣品溶液的穩(wěn)定性 取同一待測樣品溶液按上述檢測條件連續(xù)進(jìn)樣測定5次，計算各峰峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，以考查該HPLC檢測方法的精密度。取同一待測樣品溶液分別于配制后0、6、12、24 h進(jìn)樣測定，計算各峰峰面積的RSD值，以考查樣品溶液的穩(wěn)定性。

1.2.4 不同生長時期柿樹葉片中黃酮類化合物含量的變化 以湖南長沙牛心柿為材料，分別對3月28日、4月25日、5月28日、6月29日、7月25日、8月25日、9月25日和10月29日采集的柿樹葉片進(jìn)行測定，以分析不同生長時期柿樹葉片黃酮類化合物含量的變化。

1.2.5 不同品種的柿樹葉片中黃酮類化合物含量的比較 對湖南省不同地區(qū)不同品種的柿樹葉片進(jìn)行測定，以比較各品種柿樹葉片中黃酮類化合物含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC分析方法的檢驗

2.1.1 色譜圖 在1.2.2的色譜條件下，樣品中柿樹葉片黃酮類化合物各峰之間分離度較好，基本達(dá)到基線分離，色譜圖見圖1。采用該方法檢測到的柿樹葉片中黃酮類化合物峰達(dá)10個以上，且大多為未知黃酮類化合物，若要通過標(biāo)準(zhǔn)對照品來計算單一化合物的含量，就得先對各峰的物質(zhì)逐一分離提純，再進(jìn)行質(zhì)譜分析得出各峰所代表的具體物質(zhì)，這樣操作的難度較大，因此，試驗結(jié)果以峰面積總和進(jìn)行分析，以簡化操作過程，節(jié)省檢測時間。

圖1 柿樹葉片黃酮類化合物HPLC色譜圖

2.1.2 精密度和穩(wěn)定性 取同一待測樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣測定5次，各峰峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值在0.51～1.96之間，表明試驗儀器精密度良好。取同一待測樣品溶液于0、6、12、24 h進(jìn)樣測定，各峰峰面積的RSD值在0.93～1.73之間，表明待測樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定，變異系數(shù)低。

2.2 不同生長時期柿樹葉片黃酮類化合物含量的變化

從圖2中可以看出，3月下旬柿樹剛剛萌發(fā)新葉時，柿樹葉片總黃酮含量較高，隨著植株開花結(jié)果，柿樹葉片中黃酮類化合物含量逐漸降低，6月底降至最低值，而在果實膨大期，即從7月下旬開始柿樹葉片黃酮類化合物含量又逐漸升高，到果實成熟時達(dá)到全年最高值，然后柿樹葉片進(jìn)入落葉期，柿樹葉片黃酮類化合物含量有所下降，但降幅不大。

圖2 不同生長時期柿樹葉片中黃酮類化合物含量變化趨勢

2.3 不同品種柿樹葉片黃酮類化合物的含量

湖南省柿樹品種資源調(diào)查結(jié)果顯示，湖南省的柿樹品種既有次郎、陽豐、新津20、三代斤等甜柿品種（均以柿果園管理方式栽培種植）；又有腰帶柿、盅柿、牛心柿、柿花、甜柿等野生澀柿品種。由表1可知，所測樣品中柿樹葉片黃酮類化合物含量最高的是永州市祁陽縣的次郎甜柿品種，最低的是邵陽市洞口縣的腰帶柿。

表1 湖南省各地區(qū)不同柿樹品種葉片中的黃酮類化合物含量

進(jìn)一步分析可知，在同一地區(qū)，氣候條件和栽培管理條件相同的情況下，不同品種間柿樹葉片黃酮類化合物含量有明顯差異；而不同地區(qū)同一品種間含量差異較小。例如：永州市祁陽縣的次郎甜柿葉片黃酮類化合物含量要高于同一柿果園栽培種植的三代斤甜柿，但與洪江市群峰鄉(xiāng)的的次郎甜柿差異不大。另外，同一地區(qū)不同栽培管理條件下，不同品種間柿樹葉片黃酮類化合含量也有明顯差異，以柿果園栽培管理的甜柿品種柿樹葉片中黃酮類化合物的含量遠(yuǎn)高于野生澀柿品種的含量。

3 結(jié)論與討論

柿樹葉片黃酮類化合物主要以黃酮苷的形式存在，且分子結(jié)構(gòu)式多種多樣，很多試驗研究在檢測分析時采用傳統(tǒng)比色法，以蘆丁為對照品或者是將樣品水解后以槲皮素和山奈酚為對照品來計算[13-14]。而該研究在試驗過程中發(fā)現(xiàn)所制備樣品中槲皮素、山奈酚、蘆丁的含量都比較少，甚至沒有這3種物質(zhì)的存在，故不能以這幾種物質(zhì)作對照，為提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，試驗采用HPLC檢測方法，通過計算圖譜中各峰峰面積總和來分析比較樣品中黃酮類化合物的含量差異，該方法相對傳統(tǒng)的比色法而言，結(jié)果更可靠，且操作簡單。

柿為落葉果樹，葉片生長周期為3月上旬到11月中旬，根據(jù)試驗得出的柿樹葉片黃酮類化合物代謝累積規(guī)律，3月和4月上旬即新葉萌發(fā)期可結(jié)合柿樹修剪采集嫩葉制作柿樹葉片茶；9～10月果實采收后采集柿樹葉片炮制成中藥材或作為生產(chǎn)柿樹葉片提取物的原材料。

優(yōu)良品種的選擇是柿果園建設(shè)的基礎(chǔ)，試驗結(jié)果表明，柿樹葉片黃酮類化合物的含量與柿樹品種特性有直接關(guān)系，同時合理完善的栽培管理方式對提高柿樹葉片黃酮類化合物含量也有較大影響。

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