王俐萱，牛立營(yíng)，潘英妮，齊文，劉曉秋

(沈陽(yáng)藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016)

中藥工業(yè)

UPLC法測(cè)定蒲黃提取物中總黃酮醇苷的含量

王俐萱，牛立營(yíng)，潘英妮，齊文，劉曉秋*

(沈陽(yáng)藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016)

目的：建立蒲黃提取物中總黃酮醇苷的UPLC含量測(cè)定方法。方法：蒲黃提取物經(jīng)25%鹽酸水解后，應(yīng)用WATERS UPLC超高效液相色譜儀，BEH C18色譜柱，PDA檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。以甲醇-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相，流速為0.6 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為370 nm，柱溫為35 ℃。結(jié)果：槲皮素、山柰酚和異鼠李素濃度分別在1.00～12.0 μg·mL-1、1.10～13.2 μg·mL-1和3.00～36.0 μg·mL-1與峰面積呈良好的線性關(guān)系；平均加樣回收率分別為100.4%(RSD=1.8%)，98.9%(RSD=2.0%)和99.2%(RSD=2.1%)。蒲黃提取物中總黃酮醇苷按照槲皮素、山柰酚和異鼠李素含量加和折算成總黃酮醇苷含量。結(jié)論：建立的蒲黃提取物中總黃酮醇苷的UPLC含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、重現(xiàn)性好，樣品處理簡(jiǎn)便易行，為蒲黃提取物的質(zhì)量控制提供了有效的手段。

UPLC；蒲黃提取物；總黃酮醇苷；含量測(cè)定

蒲黃為香蒲科植物水燭香蒲TyphaangustifoliaL.、東方香蒲TyphaoriemalisPresl或同屬植物的干燥花粉，具有止血，化瘀，通淋的功能，用于吐血，衄血，咯血，崩漏，外傷出血，經(jīng)閉痛經(jīng)，胸腹刺痛，跌撲腫痛，血淋澀痛。研究表明，蒲黃提取物能增加冠狀動(dòng)脈血流量、降低心肌攝氧率和心肌耗氧量[1]，具有防治心肌缺血性心血管疾病、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗血小板聚集及防止血栓形成等作用[1-5]。實(shí)驗(yàn)室前期研究表明蒲黃提取物由十幾種以槲皮素、山柰酚和異鼠李素為母核的黃酮醇苷組成，主要包括香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷和槲皮素-3-O-新橙皮苷等，具有良好的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用。目前有采用HPLC測(cè)定蒲黃提取物中異鼠李素-3-O-新橙皮苷及香蒲新苷含量的報(bào)道[6]，這兩個(gè)成分均是以異鼠李素為苷元。也有文獻(xiàn)報(bào)道用HPLC測(cè)定蒲黃和蒲黃炭中異鼠李素、槲皮素、山柰酚的含量作為蒲黃總黃酮的含量[7-8]。本文建立UPLC對(duì)蒲黃提取物酸水解后槲皮素、山柰酚和異鼠李素苷元含量進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)折算得總黃酮醇苷含量，對(duì)蒲黃提取物中總黃酮醇苷含量進(jìn)行定量分析，從而對(duì)蒲黃提取物進(jìn)行質(zhì)量控制的同時(shí)也可用此法對(duì)其提取工藝進(jìn)行評(píng)價(jià)。本研究建立的UPLC測(cè)定蒲黃提取物中總黃酮醇苷的含量，與HPLC法相比，大大縮短了樣品分析時(shí)間[9-11]，此方法操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可以作為蒲黃提取物質(zhì)量控制的研究方法。

1 儀器與材料

WATERS ACQUITY 超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司，配有H-Class系統(tǒng)、自動(dòng)進(jìn)樣器與EmpowerTM軟件)，ACQUITY UPLC BEH C18柱(USA Waters公司)，F(xiàn)A120AC電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)。槲皮素、山柰酚、異鼠李素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用，批號(hào)分別為：100081-200907，110861-200808，110860-200608)，甲醇(色譜純，天津康科德科技有限公司)，乙腈(色譜純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，娃哈哈飲用純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)，試劑均為分析純。

3批蒲黃藥材購(gòu)于遼寧沈陽(yáng)藥材市場(chǎng)，產(chǎn)地分別為遼寧、內(nèi)蒙古和河北，由遼寧省食品藥品檢驗(yàn)所王維寧副主任藥師鑒定為正品，符合《中國(guó)藥典》2010年版要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm × 2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.1%甲酸溶液(45∶55)；流速：0.6 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：370 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。

在上述色譜條件下，分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液1 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。槲皮素、山柰酚和異鼠李素在3 min內(nèi)出峰，分離度良好，色譜峰理論塔板數(shù)均大于3 000，拖尾因子均在0.95～1.05，對(duì)照品和供試品色譜峰見(jiàn)圖1。

A.對(duì)照品 B.供試品1.槲皮素 2.山柰酚 3.異鼠李素圖1 蒲黃及對(duì)照品HPLC圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 蒲黃提取物制備 稱取不同批次蒲黃3份，每份100 g，加水10倍量，煎煮2次，每次1 h，冷卻過(guò)濾，合并濾液，將所得濾液吸附在AB-8大孔吸附樹(shù)脂上，分別用水、10%～90%乙醇梯度洗脫，收集總黃酮部位，減壓濃縮至干，得蒲黃提取物粉末。

2.2.2 供試品溶液制備[12]精密稱取蒲黃提取物粉末(2號(hào)樣品)約25 mg，精密稱定，加甲醇-25 %鹽酸溶液(4∶1)25 mL，置水浴中加熱回流30 min，迅速冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 對(duì)照品儲(chǔ)備液制備 精密稱取槲皮素對(duì)照品4.0 mg、山柰酚對(duì)照品4.4 mg和異鼠李素對(duì)照品12.0 mg，分別置于100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別得質(zhì)量濃度為0.04，0.044，0.12 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.25，0.5，1.0，2.0，3.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得標(biāo)準(zhǔn)系列混合對(duì)照品溶液。在2.1項(xiàng)下色譜條件分析，以對(duì)照品峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。槲皮素、山柰酚和異鼠李素回歸方程分別為Y=3 191.4X-1 081.1(r=0.999 7)，Y=3 787.3X-1 115.6(r=0.999 6)，Y=4 689X-4 961.1(r=0.999 6)。表明槲皮素、山柰酚和異鼠李素濃度分別在1.00～12.0，1.10～13.2，3.00～36.0 μg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗(yàn)

取槲皮素、山柰酚和異鼠李素質(zhì)量濃度分別為2.0，2.2，6.0 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，按峰面積計(jì)算RSD，槲皮素、山柰酚和異鼠李素峰面積的RSD分別為1.7 %，1.7 %，1.4 %，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取樣品(2號(hào)樣品)，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下放置，并按2.1項(xiàng)下色譜條件于0，4，8，12，18，24 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明供試品溶液室溫放置在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，槲皮素、山柰酚和異鼠李素峰面積的RSD分別為1.3%，1.7%，1.4%。

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn)

精密稱取樣品(2號(hào)樣品)6份，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析并記錄峰面積，計(jì)算槲皮素、山柰酚和異鼠李素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.916%,2.534%,9.393%,其RSD分別為1.9%，2.1%，2.3%，結(jié)果表明方法重現(xiàn)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取2.2.1項(xiàng)下已知含量的蒲黃提取物粉末(2號(hào)樣品)6份，每份約12.5 mg，精密稱定，分別加入槲皮素、山柰酚和異鼠李素質(zhì)量濃度為0.040，0.044，0.12 mg·mL-1的對(duì)照品溶液適量。精密加入3種對(duì)照品溶液，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)試，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.8 總黃酮醇苷含量測(cè)定

取蒲黃提取物3批，按2.2.2項(xiàng)下制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件分析測(cè)定，分別計(jì)算蒲黃提取物中槲皮素、山柰酚和異鼠李素的含量，參照文獻(xiàn)蒲黃總黃酮醇苷與其水解后苷元換算系數(shù)為2.57，總黃酮醇苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)=(槲皮素量+山柰酚量+異鼠李素量)×2.57/供試品量[8-13]，結(jié)果蒲黃提取物中槲皮素、山柰酚和異鼠李素含量及總黃酮醇苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)見(jiàn)表2。

表1 蒲黃提取物中3種成分回收率試驗(yàn)

表2 蒲黃提取物中總黃酮醇苷的測(cè)定 /%

3 討論

3.1 蒲黃提取物中黃酮類成分測(cè)定指標(biāo)選擇的依據(jù)

以前的研究多采用HPLC測(cè)定異鼠李素-3-O-新橙皮苷及香蒲新苷的含量對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制，這兩種黃酮苷均以異鼠李素為母核，而蒲黃及其提取物中含多種黃酮，主要是以異鼠李素、槲皮素和山柰酚為母核的黃酮醇苷類化合物。因此，為了反映蒲黃黃酮中黃酮醇苷成分的含量，筆者建立了蒲黃提取物中總黃酮醇苷的UPLC含量測(cè)定方法，對(duì)蒲黃提取物中不易測(cè)定的黃酮苷類成分，通過(guò)酸水解法轉(zhuǎn)化為槲皮素、山柰酚和異鼠李素3種苷元形式進(jìn)行含量測(cè)定，更準(zhǔn)確地對(duì)蒲黃提取物進(jìn)行質(zhì)量控制。

3.2 3種苷元選擇的依據(jù)

陶偉偉等[14]采用HPLC-PDA-MS技術(shù)對(duì)蒲黃中黃酮醇苷類成分進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明蒲黃黃酮中異鼠李素-3-O-新橙皮苷和香蒲新苷含量最多，此外還有槲皮素-3-O-(2G-α-L-鼠李糖基)-蕓香糖苷，槲皮素-3-O-新橙皮苷，山柰酚-3-O-(2G-α-L-吡喃鼠李糖基)-蕓香糖苷，山柰酚-3-O-新橙皮苷，異鼠李素-3-O-蕓香糖苷，異鼠李素-3-O-葡萄糖苷等，其均是以槲皮素、山柰酚和異鼠李素為母核的黃酮醇苷類化合物。本方法選用蒲黃黃酮的主要苷元槲皮素、山柰酚和異鼠李素作為測(cè)定指標(biāo)具有合理性。

3.3 樣品含量測(cè)定結(jié)果以及總黃酮醇苷計(jì)算說(shuō)明

總黃酮醇苷的含量測(cè)定參照《中國(guó)藥典》銀杏葉提取物法，將蒲黃提取物中的黃酮醇苷類化合物經(jīng)水解后分別測(cè)出槲皮素、山柰酚及異鼠李素的含量，三者均為黃酮醇苷類化合物的苷元，故不以單個(gè)含量分別表示，而經(jīng)公式轉(zhuǎn)化為總黃酮醇苷含量計(jì)算。經(jīng)計(jì)算總黃酮醇苷含量(2號(hào)樣品)為35.32%，其中異鼠李素、槲皮素和山柰酚分別占67.76%，13.87%，18.36%。

3.4 流動(dòng)相的選擇

分別對(duì)甲醇-水、甲醇-冰醋酸水溶液、甲醇-甲酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液作為流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行考察。結(jié)果表明，各色譜峰的對(duì)稱性在甲醇-0.1%甲酸水溶液中比甲醇-水流動(dòng)相系統(tǒng)得到明顯改善，而甲醇-冰醋酸水溶液及乙腈-甲酸水溶液系統(tǒng)作為流動(dòng)相對(duì)峰型及分離度影響不大，故選擇甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相系統(tǒng)。

本文所建立的蒲黃提取物中總黃酮醇苷的UPLC含量測(cè)定方法快速、準(zhǔn)確，與傳統(tǒng)的HPLC含量測(cè)定方法相比，樣品運(yùn)行時(shí)間大大縮短，峰形與分離度均較好，可使上述3個(gè)黃酮醇得到有效分離。本方法回收率好、精密度與穩(wěn)定性高、操作簡(jiǎn)便，為蒲黃提取物中總黃酮醇苷的含量測(cè)定提供依據(jù)，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定基礎(chǔ)。

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ContentDeterminationofTotalFavonolGlycosidedsofTyphaePollenExtractbyUPLC

WANG Lixuan，NIULiying，PANYingni，QIWen，LIUXiaoqiu*

(SchoolofTraditionalChineseMateriaMedica，ShenyangPharmaceuticalUniversity，Shenyang110016，China)

Objective：To establish a method for determination the total flavonol glycosides in Pollen Typhae extract by UPLC.Methods：Typhae Pollen extract which was acid hydrolysis by 25% hydrochloric.Chromatographic separation was carried out by the method of UPLC，the BEH C18column was used as chromatographic column，and methanol-0.1% formic acid water solution as mobile phase with a flow rate at 0.6 mL·min-1.The detection wavelength was 370 nm and column temperature was maintained at 35℃.Results：There was a good linear relationship which quercitrin，kaempferol and isorhanetin in the range of 1.00-12.0 μg·mL-1，1.10-13.2 μg·mL-1and 3.00-36.0 μg·mL-1，respectively.The average recoveries of quercitrin，kaempferol and isorhanetin were 100.4%(RSD=1.8%，n=6)，98.9%(RSD=2.0%，n=6)and 99.2%(RSD=2.1%，n=6)，respectively.The content of total flavonol glycosides in Pollen Typhae extract is based on amortized contents of quercitrin，kaempferol and isorhanetin.Conclusion：This method is simple in operation，high in sensitivity and good in reproducibility，and can be used for the determination of Pollen Typhae extract.

UPLC；Typhae Pollen extract；Total flavonol glycosides；Content

2014-04-21)

*

劉曉秋，博士，教授，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及中藥質(zhì)量控制；Tel：(024)23986469，E-mail：liuxiaoqiu3388@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.09.011