陳靜琦，朱必勝，侯開連

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤科，廣東廣州510260）

整合素是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的主要分子，其中整合素β1主要介導(dǎo)細(xì)胞與纖維粘連蛋白（FN）的黏附［1］。以前認(rèn)為細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附抑制細(xì)胞的遷移，但現(xiàn)在研究認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞只有黏附于細(xì)胞外基質(zhì)，才可以抵抗失巢性凋亡，而遷移就是細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上伸出偽足，在偽足的前緣依靠整合素形成黏附，而細(xì)胞體的后緣則去黏附，使得整個(gè)細(xì)胞體前移，整個(gè)細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上爬行，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的浸潤(rùn)和遷移［2］。但是，什么樣的機(jī)制調(diào)控了腫瘤細(xì)胞這個(gè)黏附與去黏附的過程，目前還不清楚。

趨化因子分為CXC、CC、C等幾種類型，大量研究已經(jīng)證明趨化因子及其受體在腫瘤的浸潤(rùn)和遷移中起關(guān)鍵的作用，例如SDF－1作用于受體CXCR4促進(jìn)腫瘤遷移，CCL5、CCL2在腫瘤轉(zhuǎn)移中均起關(guān)鍵的作用［3］。但在趨化因子促進(jìn)腫瘤趨化的過程中，發(fā)揮黏附功能的整合素起什么樣的作用，還沒有充分證明。CCL18是一種CC型的趨化因子［4］，本研究前期已經(jīng)證明乳腺癌細(xì)胞表達(dá)CCL18的受體PITPNM3，CCL18通過作用于PITPNM3產(chǎn)生乳腺癌細(xì)胞的趨化作用，從而促進(jìn)乳腺癌浸潤(rùn)和遷移［5］，本文將進(jìn)一步研究CCL18促進(jìn)乳腺癌SK－3rd細(xì)胞浸潤(rùn)和遷移的分子機(jī)制，探討整合素在CCL18促遷移過程中的作用，為靶向腫瘤微環(huán)境的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 利用從ATCC購買的乳腺癌SKBR3細(xì)胞系構(gòu)建SK－3rd細(xì)胞系；Transwell培養(yǎng)板購自Corning公司，微孔直徑為0.4μm；FN購自美國(guó)Roche公司。細(xì)胞培養(yǎng)板購自Corning公司；CCL18蛋白購自R＆D公司；整合素α5β1抗體購自美國(guó)Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清的DMEM）中培養(yǎng)SK－3rd細(xì)胞。

1.2.2 流式細(xì)胞檢測(cè) 用CCL18（20ng／mL）處理SK－3rd乳腺癌細(xì)胞1h，然后用PBS洗滌細(xì)胞，再用鼠抗人整合素α5β1抗體4℃孵育細(xì)胞15min，用同型抗體作為對(duì)照，PBS洗滌后，再加入PE標(biāo)記的熒光二抗（BD Biosciences），避光情況下室溫孵育20min，然后用流式細(xì)胞儀（BD Biosciences）檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞整合素α5β1的聚集情況。以非相關(guān)蛋白人血清蛋白（ALB）處理組和未處理組（PBS）為對(duì)照。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

圖1 CCL18促進(jìn)乳腺癌SK－3rd細(xì)胞表面整合素α5β1的聚集

1.2.3 Western blot檢測(cè) 收集培養(yǎng)、誘導(dǎo)成功的細(xì)胞，加入混有蛋白酶抑制劑（Merk）的RIPA裂解液（150nmol NaCL，1%NP－40，0.5%去氫醋酸鈉，0.1%十二烷基硫酸鈉（SDS），50mmol三羥甲基氨基甲烷，pH 8.0），提取細(xì)胞總蛋白，作蛋白定量。制備電泳SDS凝膠后，每個(gè)泳道加入10～50μg提取蛋白電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜（Millipore），洗膜，孵育針對(duì)Tyr397－黏著斑激酶（FAK）和β－actin的一抗（美國(guó)CST公司），洗膜，用標(biāo)記辣根過氧化酶的對(duì)應(yīng)的IgG二抗（美國(guó)CST公司）孵育?？乖贵w結(jié)合用化學(xué)發(fā)光劑（Thermo）觀測(cè)。在培養(yǎng)板包被或不包被FN的條件下，用Western blot的方法檢測(cè)CCL18對(duì)乳腺癌SK－3rd細(xì)胞FAK的影響。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.4 靶向整合素β1的siRNA轉(zhuǎn)染 胰酶消化SK－3rd細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM（Gibco）懸浮細(xì)胞，37℃放置。使siPoRT NeoFX轉(zhuǎn)染試劑（Ambion）和OPTI－MEM Ⅰ培養(yǎng)基（Invitrogen）恢復(fù)至室溫。根據(jù)說明書溶解siPORT NeoFX在OPTI－MEMⅠ培養(yǎng)基中，常溫下孵育10min。把siRNA按所需的終濃度（30nmol）溶解在OPTI－MEM Ⅰ培養(yǎng)基中?；旌先芙獾膕iRNA和轉(zhuǎn)染試劑，常溫下孵育10min，把混合液加入培養(yǎng)板，再把細(xì)胞懸液加到轉(zhuǎn)染混合物上面，輕搖培養(yǎng)板。轉(zhuǎn)染細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48h，然后用于黏附實(shí)驗(yàn)。整合素β1的siRNA－1上游引物：5′－GGA AAU GGU GUU UGC AAG U－3′，下游引物：5′－ACU UGC AAA CAC CAU UUC C－3′；整合素β1的siRNA－2上游引物：5′－AAU GUA ACC AAC CGU AGC ATT－3′，下游引物：5′－ACU UGC AAA CAC CAU UUC C－3′。

1.2.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 在Transwell上層小室（24 wells，8μm，Corning）底部膜的下表面鋪10μL FN（40μg／mL，Roche），4℃放置48h；把50μL Matrigel（用無血清培養(yǎng)基1∶3稀釋，R＆D）加入Transwell的嵌套內(nèi)，37℃孵育30 min。消化收集SK－3rd乳腺癌細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基（DMEMF12加入2%B27、胰島素140IU和0.4%BSA）制細(xì)胞懸液，把乳腺癌細(xì)胞加入Transwell上室（105cells／well），下層小室加20%的胎牛血清和CCL18蛋白。培養(yǎng)8h后，用棉簽去除Transwell上層小室內(nèi)的基質(zhì)膠，用多聚甲醛固定黏附在Transwell小室膜下表面的侵襲細(xì)胞，用結(jié)晶紫（0.005%，sigma）染色，在400倍的光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)選取10個(gè)視野計(jì)數(shù)，同時(shí)拍攝圖片，獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。在CCL18存在（un組）或CCL18不存在（con組）的條件下，在Transwell培養(yǎng)板中，檢測(cè)轉(zhuǎn)染整合素β1－siRNA（si－int－1組、si－int－2組）的乳腺癌 SK－3rd細(xì)胞浸潤(rùn)遷移功能（n＝3），以單用轉(zhuǎn)染試劑（mock組）、轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白（GFP）的siRNA（si－GFP組）為對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1 CCL18促進(jìn)SK－3rd乳腺癌細(xì)胞表面整合素α5β1的聚集乳腺癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附在乳腺癌的浸潤(rùn)和遷移過程中起關(guān)鍵的作用，整合素是乳腺癌細(xì)胞表面的黏附分子，故在乳腺癌細(xì)胞黏附和浸潤(rùn)遷移中起關(guān)鍵的作用，本結(jié)果表明CCL18作用于乳腺癌細(xì)胞，引起SK－3rd細(xì)胞表面整合素α5β1的聚集（圖1），從而啟動(dòng)了乳腺癌細(xì)胞黏附于細(xì)胞外基質(zhì)的過程。

2.2 CCL18促進(jìn)SK－3rd乳腺癌細(xì)胞中FAK的磷酸化激活本研究用CCL18和細(xì)胞外基質(zhì)FN處理乳腺癌SK－3rd細(xì)胞，用Wester blot檢測(cè)FAK的磷酸化激活，結(jié)果觀察到CCL18可以使SK－3rd細(xì)胞中在Tyr397位點(diǎn)磷酸化FAK蛋白量升高，表明CCL18可以磷酸化激活FAK，見圖2。

圖2 CCL18引起乳腺癌SK－3rd細(xì)胞中FAK的激活

圖3 各組SK－3rd乳腺癌細(xì)胞浸潤(rùn)和遷移比較

2.3 CCL18通過整合素促進(jìn)SK－3rd乳腺癌細(xì)胞浸潤(rùn)和遷移在證明CCL18可以引起整合素在乳腺癌細(xì)胞表面聚集的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步把針對(duì)整合素β1的siRNA通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入乳腺癌細(xì)胞，經(jīng)過48h沉默整合素β1的表達(dá)，檢測(cè)CCL18對(duì)乳腺癌SK－3rd細(xì)胞浸潤(rùn)和遷移的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，與沒有CCL18處理組比較，CCL18使乳腺癌SK－3rd細(xì)胞浸潤(rùn)遷移數(shù)量增加10倍（P＜0.01，圖3），轉(zhuǎn)染GFP siRNA或單純加入脂質(zhì)體（mock）沒有影響CCL18促乳腺癌細(xì)胞浸潤(rùn)和遷移的作用，轉(zhuǎn)染靶向整合素β1的siRNA－1和si－RNA－2可以抑制CCL18促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞浸潤(rùn)和遷移的作用，浸潤(rùn)和遷移細(xì)胞數(shù)恢復(fù)到?jīng)]有CCL18作用的水平（P＞0.05，圖3），證明CCL18通過促進(jìn)整合素的聚集可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞浸潤(rùn)和遷移。

3 討 論

以前的研究認(rèn)為細(xì)胞的黏附抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和遷移，但細(xì)胞黏附功能的系統(tǒng)研究認(rèn)為，細(xì)胞的黏附分為細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附和細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附［6］，如果沒有細(xì)胞與周圍細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，細(xì)胞就會(huì)出現(xiàn)失巢性凋亡，就不能維持增殖、遷移的生物學(xué)功能［7］。腫瘤細(xì)胞在周圍環(huán)境的支撐下，在微環(huán)境中生物活性因子的誘導(dǎo)下，運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，浸潤(rùn)和遷移的能力增強(qiáng)［8］，實(shí)質(zhì)上腫瘤細(xì)胞的遷移是細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上的一種滾動(dòng)樣的爬行。整合素是腫瘤細(xì)胞表面的黏附分子，是細(xì)胞外基質(zhì)成分的受體［9］，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附［10］。整合素發(fā)揮黏附功能，首先表現(xiàn)為聚集［11］，而且腫瘤細(xì)胞周圍的生物活性因子可以作用于腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)整合素的聚集，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的黏附功能。

趨化因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的趨化［11－12］。CCL18在乳腺癌微環(huán)境中，是一種來源于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor associated macrophages，TAM）的CC型趨化因子［13］，在本研究前，關(guān)于CCL18的研究主要集中在CCL18對(duì)樹突狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的趨化作用［14］，還少有研究CCL18對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用，嚴(yán)重影響了這種趨化因子功能的闡明。本課題的前期研究證明CCL18與乳腺癌細(xì)胞表面受體PITPNM3結(jié)合，促進(jìn)乳腺癌浸潤(rùn)和遷移，CCL18可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞黏附于細(xì)胞外基質(zhì)［5］。

在本研究證明TAM來源的CCL18作用于乳腺癌細(xì)胞，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞表面整合素α5β1的聚集，整合素的聚集引起黏著斑形成，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞黏附。整合素α5β1的配體是細(xì)胞外基質(zhì)中的FN，CCL18引起整合素α5β1聚集的同時(shí)，引起乳腺癌細(xì)胞內(nèi)FAK的磷酸化激活，從而進(jìn)一步激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，同時(shí)也證明沉默整合素β1，抑制CCL18促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞黏附的功能，可以抑制CCL18促進(jìn)乳腺癌浸潤(rùn)和遷移的作用。說明整合素介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞黏附于細(xì)胞外基質(zhì)是乳腺癌浸潤(rùn)和遷移的關(guān)鍵步驟，初步闡明了CCL18促進(jìn)乳腺癌浸潤(rùn)和遷移的機(jī)制，為抑制CCL18促乳腺癌浸潤(rùn)遷移提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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