王 林，李 波，耿智敏#，徐之超，陳 晨，李文智，鄭見寶

1)西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院肝膽外科 西安 710061 2)西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院普通外科 西安 710061

肝纖維化系指肝組織內(nèi)細胞外基質(zhì)(extracellualr matrix，ECM)過度增生與異常沉積，最終導致肝臟結(jié)構(gòu)和功能異常的病理變化，進而發(fā)展為肝硬變[1]。肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的持續(xù)激活是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，抑制HSC活化、增殖成為目前阻斷、逆轉(zhuǎn)肝纖維化的重要策略。索拉菲尼作為一種多靶點、多激酶抑制劑靶向治療藥物，能明顯抑制HCC細胞增殖及血管新生[2]，但其對 HSC有無作用，此方面研究較少。該研究通過體外實驗觀察索拉菲尼對HSC活性及活化狀態(tài)的影響，為索拉菲尼治療肝纖維化提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 人HSC細胞系(LX2)購自中南大學湘雅中心實驗室;索拉菲尼由拜耳公司饋贈，劑型200 mg/片，用體積分數(shù)100%DMSO溶解，－20℃保存。α-SMA兔抗人單抗購自美國Abcam公司，β-actin兔抗人單抗購自北京博奧森公司，ERK1/2兔抗人單抗、p-ERK1/2兔抗人單抗、AKT羊抗人單抗、p-AKT羊抗人單抗、兔抗羊二抗、羊抗兔二抗等購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。TGF-β1和PDGF-BB ELISA檢測試劑盒購自美國R＆D公司。

1.2 細胞培養(yǎng) LX2細胞在37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3 MTT法測定索拉菲尼對LX2細胞的增殖抑制率 取LX2細胞，以5×104孔－1的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后加入索拉菲尼，藥物濃度分別為0(對照)、1、2、5、10、20、50 μmol/L，每種濃度設(shè) 3個復孔。加藥后分別培養(yǎng)12、24、36、48 h，然后每孔加MTT(5 g/L)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去原培養(yǎng)液，加入 DMSO 150 μL/孔，振蕩 10 min，用酶標儀(波長490 nm)測定每孔的A值，增殖抑制率=(對照組A值－實驗組A值)/對照組A值×100%。

1.4 免疫細胞化學法檢測LX2細胞α-SMA的表達 ①細胞爬片:取LX2細胞，制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度為(1～5)×105mL－1。移液器吸取細胞懸液500 μL，分別接種于5組蓋玻片上。培養(yǎng)箱孵育4 h，移液器輕輕移去培養(yǎng)液，對照組加1 mL培養(yǎng)液，實驗組分別加入1 mL 含1、2、5、10 μmol/L 索拉菲尼的培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。②免疫細胞化學染色:40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS洗3遍，體積分數(shù)3%H2O2封閉10 min，PBS洗3遍，山羊血清封閉(室溫下1 h)，甩去山羊血清，加入α-SMA一抗，4℃冰箱過夜。PBS洗3遍，加ABC復合物，室溫下30 min～1 h，DAB顯色，蘇木素復染，自來水沖洗，自然風干后，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察α-SMA表達情況，并于400倍鏡下選取6個視野進行計分。陽性細胞百分比計分:按照陽性細胞占所有細胞的比例計分，0、＜25%、25% ～、50% ～、75% ～分別為0、1、2、3、4 分。著色強度計分:細胞無著色，0分;淺黃色，1分;棕黃色，2分;棕褐色，3分。2項評分結(jié)果相加，0分為陰性(－)，1～分為弱陽性(+)，4～分為中等陽性(?)，6～7分為強陽性(?)。各組分別設(shè)置4個復孔。

1.5 ELISA 法檢測 TGF-β1和 PDGF-BB 實驗組使用含1、2、5、10 μmol/L 索拉菲尼的培養(yǎng)液，對照組用未加索拉菲尼的單純培養(yǎng)液。分別干預LX2細胞12、24、36 h后，提取上清，使用 ELISA試劑盒檢測上清中TGF-β1和PDGF-BB的水平。各組分別設(shè)置5個復孔。

1.6 Western blot檢測 AKT/p-AKT 和 ERK1、ERK2/p-ERK1、p-ERK2取LX2細胞，培養(yǎng)液分別為未添加索拉菲尼和含索拉菲尼1、2、5、10 μmol/L的培養(yǎng)液。培養(yǎng)0.5 h后，倒棄培養(yǎng)液，添加400 μL裂解液，置于冰盒上1 h，離心提取蛋白，蛋白定量后上樣20 μL，行Western blot檢測各組不同蛋白表達情況。實驗內(nèi)參為β-actin。每組重復3次。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)分析。采用析因設(shè)計的方差分析比較各組LX2細胞增殖抑制率、上清 TGF-β1和PDGF-BB水平的差異，各組α-SMA表達情況的比較采用Kruskual-Wallis多組等級資料的秩和檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 索拉菲尼對LX2細胞增殖能力的影響 結(jié)果見表1。

2.2 免疫細胞化學染色法檢測LX2細胞α-SMA的表達 對照組均有α-SMA表達，1、2、5 μmol/L實驗組均有α-SMA表達，但10 μmol/L組幾乎無正常形態(tài)細胞，α-SMA表達也明顯減弱。見圖1和表2。

2.3 ELISA 法檢測 TGF-β1與 PDGF-BB 結(jié)果見表 3、4。

表1 各組LX2細胞的增殖抑制率比較(n=3) %

圖1 索拉菲尼作用24 h后LX2細胞α-SMA表達情況(SABC，×100)

表2 各組LX2細胞α-SMA表達情況(n=24)視野

表3 各組上清TGF-β1水平(n=5) μg/L

表4 各組上清PDGF-BB水平(n=5) ng/L

2.4 Western blot檢測結(jié)果 見圖2?？芍?，各組ERK1、ERK2、AKT 蛋白表達量基本相同，10 μmol/L組 p-AKT、p-ERK1、p-ERK2蛋白表達降低。

圖2 各組AKT/p-AKT和ERK1、ERK2/p-ERK1、p-ERK2蛋白表達情況

3 討論

索拉菲尼屬于分子靶向治療新藥，是一種多靶點、多激酶抑制劑，在抑制肝癌細胞方面已取得重大進展。其作用機制主要為2個方面[2-3]:①通過阻斷MAPK通路抑制腫瘤細胞增殖。②通過阻斷VEGF受體和PDGF受體，抑制腫瘤血管生成。近年來研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，索拉菲尼除了可抑制上皮癌細胞的增殖外，還可調(diào)節(jié)鄰近間質(zhì)細胞的受體酪氨酸激酶信號通路。

活化的HSC是肝纖維化發(fā)生時ECM的主要來源[6]。已有研究[7]表明，索拉菲尼用于門靜脈高壓癥可顯著改善血流動力學、抑制新生血管形成、減輕肝臟的纖維化，明顯降低門靜脈壓力。索拉菲尼是否可以抑制HSC的活性及活化，繼而阻斷、逆轉(zhuǎn)肝纖維化，該實驗對此進行了研究。

實驗發(fā)現(xiàn)，索拉菲尼可抑制LX2細胞活性，還發(fā)現(xiàn)藥物濃度越高索拉菲尼的抑制作用越明顯，且隨著時間的延長索拉菲尼的抑制作用表現(xiàn)得也越明顯。但在48 h時，LX2細胞活性有所恢復，考慮與索拉菲尼藥代動力學因素有關(guān)。故隨后實驗作者選用的藥物濃度為 1、2、5 和 10 μmol/L，作用時間為12、24 和36 h。

實驗中以不同濃度索拉菲尼干預LX2細胞12、24和36 h后，發(fā)現(xiàn)其作用機制表現(xiàn)為以下幾方面:①索拉菲尼抑制LX2細胞的活化，而α-SMA的表達為HSC活化的標志，活化的HSC是肝纖維化發(fā)生和發(fā)展的核心環(huán)節(jié)。免疫細胞化學法檢測α-SMA的表達時發(fā)現(xiàn)，對照組和實驗組中α-SMA的表達有差異，證明索拉菲尼可抑制LX2細胞活化。②索拉菲尼可抑制LX2細胞分泌某些細胞活性因子，包括PDGF-BB和TGF-β1。細胞因子分泌作為HSC活化重要特征之一，主要表現(xiàn)在TGF-β1、PDGF-BB等大量分泌。該實驗通過ELISA法檢測不同水平索拉菲尼干預下提取的LX2細胞上清中PDGF-BB、TGF-β1的表達量發(fā)現(xiàn)，隨著藥物水平的升高，PDGF-BB和TGF-β1在上清中的水平呈遞減趨勢，而同一藥物水平下，隨著時間的延長，PDGF-BB和TGF-β1也呈遞減表達，進而達到抑制LX2細胞活化的目的。③索拉菲尼通過抑制LX2細胞的PDGF信號通路，從而抑制其活化。該實驗通過Western blot方法檢測Ras/ERK通路中ERK1/ERK2和p-ERK1/p-ERK2以及PI3K通路中AKT和p-AKT的變化，可評估索拉菲尼對PDGF信號通路的影響。作者發(fā)現(xiàn)對照組和實驗組ERK1/ERK2及AKT表達水平基本相同，而其相應(yīng)的磷酸化狀態(tài)，實驗組表達逐漸減弱，說明索拉菲尼可抑制PDGF信號通路中ERK1/ERK2及AKT的磷酸化，阻斷了PDGF細胞通路的正常傳導，從而抑制LX2細胞的活化、增殖。

綜上，該研究初步證實索拉菲尼可下調(diào)HSC上清液中PDGF-BB和TGF-β1的分泌，抑制 PDGF信號通路，最終抑制HSC的活化及活性，為索拉菲尼治療肝纖維化提供了新的理論依據(jù)。

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[2]Wilhelm SM，Adnane L，Newell P，et al.Preclinical overview of sorafenib，a multikinase inhibitor that targets both Raf and VEGF and PDGF receptor tyrosine kinase signaling[J].Mol Cancer Ther，2008，7(10):3129

[3]Liu L，Cao Y，Chen C，et al.Sorafenib blocks the RAF/MEK/ERK pathway，inhibits tumor angiogenesis，and induces tumor cell apoptosis in hepatocellular carcinoma model PLC/PRF/5[J].Cancer Res，2006，66(24):11851

[4]Martinelli E，Troiani T，Morgillo F，et al.Synergistic antitumor activity of sorafenib in combination with epidermal growth factor receptor inhibitors in colorectal and lung cancer cells[J].Clin Cancer Res，2010，16(20):4990

[5]Wilhelm S，Carter C，Lynch M，et al.Discovery and development of sorafenib:a multikinase inhibitor for treating cancer[J].Nat Rev Drug Discov，2006，5(10):835

[6]紀輝，遲寶榮，張一寧.肝纖維化與肝星狀細胞[J].吉林大學學報:醫(yī)學版，2008，34(3):538

[7]朱云，程旸，李愛民，等.索拉菲尼對門靜脈高壓癥的治療作用及其機制[J].南方醫(yī)科大學學報，2014，34(1):133