周 瑾，陳香美，劉述文，傅 博，馮 哲，洪 權(quán)

解放軍總醫(yī)院 腎病中心暨國家重點實驗室，北京 100853

TGF-β1對誘導腎間質(zhì)成纖維細胞活化并表達MMP-9及TIMP-1的影響

周 瑾，陳香美，劉述文，傅 博，馮 哲，洪 權(quán)

解放軍總醫(yī)院 腎病中心暨國家重點實驗室，北京 100853

目的研究轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor beta-1，TGF-β1)誘導的腎間質(zhì)成纖維細胞(NRK-49F)發(fā)生表型轉(zhuǎn)化時基質(zhì)金屬降解酶MMP-9及其抑制因子TIMP-1表達的變化及對分泌纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)的影響。方法以不同濃度hTGF-β1(0 ng/ml、0.5 ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml)刺激NRK-49F細胞48 h，分別應用ELISA法檢測細胞上清FN的濃度，免疫熒光檢測細胞表型標記物α-SMA、Vimentin的表達，Western blot、Northern blotting方法檢測MMP-9、TIMP-1的基因及蛋白質(zhì)表達。結(jié)果0.5 ～ 10 ng/ml TGF-β1隨刺激濃度增高NRK-49F細胞表達α-SMA明顯增多、Vimentin明顯減少，細胞上清中FN的含量顯著增加(P＜0.05或P＜0.01)；同時，TGF-β1濃度＞2 ng/ml時顯著上調(diào)TIMP-1 mRNA及蛋白表達水平(P＜0.05或P＜0.01)；以上效應均呈濃度依賴性，但對細胞MMP-9 mRNA及蛋白表達無明顯影響(P＞0.05)。結(jié)論TGF-β1能誘導腎間質(zhì)成纖維細胞活化，使FN的分泌增多，該作用可能與TGF-β1上調(diào)了TIMP-1基因及蛋白質(zhì)水平，進而減少細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的降解有關。

轉(zhuǎn)化生長因子-β1；腎間質(zhì)成纖維細胞；表型轉(zhuǎn)化α-平滑肌肌動蛋白；纖維連接蛋白；基質(zhì)金屬蛋白酶9；組織金屬蛋白酶抑制劑1

腎中肌成纖維細胞(myofibroblast，MFB)的產(chǎn)生、積聚與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關，是腎間質(zhì)纖維化的重要機制之一，其主要源于腎間質(zhì)成纖維細胞[1-3]。TGF-β1是目前公認最強的致纖維化因子，在損傷、炎癥等情況下參與了腎間質(zhì)成纖維細胞的活化及細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的大量積聚過程，而ECM的降解與重建在體內(nèi)受多種蛋白溶解酶及其抑制物的調(diào)節(jié)[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1對腎細胞外基質(zhì)代謝酶基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及其抑制因子(TIMPs)的表達有調(diào)控作用，并與腎間質(zhì)纖維化的程度密切相關[7-8]。但MMPs或TIMPs在腎間質(zhì)成纖維細胞被激活后對細胞外基質(zhì)過度積聚的影響目前研究較少。本文首先觀察TGF-β1體外對大鼠腎間質(zhì)成纖維細胞表型及分泌FN的影響，在此基礎上進一步研究TGF-β1對腎間質(zhì)成纖維細胞表達MMP-9及TIMP-1的影響，以期揭示TGF-β1體外促進ECM積聚的內(nèi)在機制。

材料和方法

1 材料 正常大鼠腎間質(zhì)成纖維細胞株NRK-49F(ATCC 公司 )，hTGF-β1(Promega公司 )，小鼠抗α-SMA(clone 1A4)(Sigma公司)，小鼠抗-Vimenin單克隆抗體(clong V9)(北京中山生物技術公司)，anti-mouse IgG-FITC抗 體、Fibronectin(ELISA)測定試劑盒(上海太陽生物技術公司)，羊抗Actin(I-19)抗體、羊抗MMP-9、兔抗TIMP-1抗體(Santa Cruz公司 )，DMEM/F12 培養(yǎng)基 (GIBCO 公司 )，[α-32P]dCTP(北京亞輝生物醫(yī)學工程公司)，Antimouse IgG/HRP、ECL顯色試劑(北京中山生物技術公司)。MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱(SANYO Electric Co.，Ltd.Japan)，超凈工作臺(北京半導體設備一廠)，Olympus K10型倒置熒光顯微鏡(Olympus Co.，Ltd.Japan)，電泳槽、電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)膜儀、干膠機、Radiance-2000系統(tǒng)激光共聚焦顯微鏡(均為美國Bio-RAD公司)，Model 2000雜交箱、雜交桶及紫外交聯(lián)儀(均為Robbins scientific公司)，AlphalmagerTM2200凝膠成像及分析系統(tǒng)(Pharmega公司 )。

2 細胞培養(yǎng)及分組 NRK-49F細胞株用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)在6孔板(預鋪有蓋玻片)或75 cm2的培養(yǎng)瓶中，細胞融合達60% ～ 70%，換含1% FBS的DMEM/F12同步24 h后分6組給予刺激：TGF-β1按照 0 ng/ml、0.5 ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml 6個不同濃度組分別加入無血清培養(yǎng)基中，其中0 ng/ml組以20 mmol/L PBS(pH6.8)代替，37℃，5% CO2培養(yǎng)48 h后中止，收獲細胞進行檢測。

3 α-SMA、Vimentin免疫熒光染色 按文獻[9]方法進行間接免疫熒光染色：接種在6孔板中的細胞用預冷的PBS洗2次，立即用甲醇：丙酮(1∶1)-20℃固定，PBS洗3次，用含0.2% TritonX-100和1.5%BSA/PBS在4℃透化5 min，用含1.5% BSA/PBS洗3次，加入小鼠抗α-SMA、抗Vimentin單抗(均1∶50稀釋)，37℃濕盒中孵育1 ～ 2 h，用1.5% BSA/PBS洗3次，加入抗Mouse-IgG-FITC(1∶200稀釋)，37℃濕盒中避光孵育1 h，再用含1.5% BSA/PBS洗3次，RNAase(100 μg/ml)37℃濕盒中避光20 min，PBS洗 3次，50 μg/ml PI染核 2 min，PBS洗 棄，激光共聚焦顯微鏡下觀察、掃描，胞質(zhì)呈絲狀綠色熒光為陽性表達，并用LaserPix 4.0圖像分析軟件定量分析單位細胞質(zhì)的平均熒光強度，用平均灰度值表示(A)，反映NRK-49F細胞陽性表達的強度。

4 ELISA法測定細胞上清FN含量 收集細胞上清液，離心取上清，以間接競爭抑制ELISA法測定FN含量(按試劑盒說明操作)，每組設6個復孔。

5 Western blot檢測MMP-9、TIMP-1的蛋白表達細胞接種在75 cm2培養(yǎng)瓶中，刺激結(jié)束時用1×RIPA裂解緩沖液(0.05 mol/L Tris pH7.4，0.15 mol/L NaCl，1% NP-40，1 mmol/L EDTA) 及 100 μg/ml PMSF，2 μg/ml Pepstatin A，2 μg/ml Leupeptin 提取細胞總蛋白，BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度。用等體積的2×SDS凝膠加樣緩沖液100℃變性蛋白，進行12% SDS-PAGE電泳，采用電轉(zhuǎn)印方法將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，室溫封閉1 h，加羊抗MMP-9抗體、兔抗TIMP-1抗體(分別為1∶100、1∶100、1∶200稀釋)4℃過夜，充分洗膜后，加HP標記的二抗(1∶1 000稀釋)室溫45 min，洗膜后用ECL系統(tǒng)顯色，顯影膠片掃描并用AlphalmagerTM2200圖像分析系統(tǒng)進行灰度分析。

6 Northern blotting檢 測 MMP-9、TIMP-1 mRNA的表達 細胞接種在75 cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)終止時用0.1% DEPC/PBS洗細胞2次，采用Trizol試劑(Gibco公司)一步法提取細胞總RNA，20 μg總RNA在1%瓊脂糖凝膠中電泳后，轉(zhuǎn)移至尼龍膜，用[α-32P]dCTP標記的cDNA探針42℃雜交過夜，洗膜，放射自顯影，顯影膠片掃描并用AlphalmagerTM2200圖像分析系統(tǒng)進行灰度分析。以28sRNA為參照校正取樣量。MMP-9、TIMP-1的cDNA探針為Glassmilk純化的RT-PCR反應產(chǎn)物，其中各引物序列、產(chǎn)物片段及PCR擴增退火溫度見表1。

結(jié) 果

1 不同濃度TGF-β1對細胞Vimentin、α-SMA免疫熒光表達的影響 激光共聚焦顯微鏡下觀察，正常NRK-49F細胞α-SMA的表達基本呈陰性，而Vimentin的表達呈強陽性，0.5 ng/ml TGF-β1刺激48 h后，細胞質(zhì)中Vimentin的熒光強度下降并隨著TGF-β1刺激濃度的升高，Vimentin表達下降顯著，在10 ng/ml濃度時Vimentin的表達幾乎全部消失。同時，0.5 ng/ml TGF-β1刺激NRK-49F細胞48 h時細胞質(zhì)中可見綠色熒光呈絲狀，為α-SMA的陽性表達，并隨著TGF-β1刺激濃度逐漸升高，細胞質(zhì)中出現(xiàn)大量纖維絲狀甚至集結(jié)成束狀的α-SMA，熒光強度也逐漸增強。0.5 ng/ml以上TGF-β1刺激各組細胞Vimentin表達與0 ng/ml組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。圖1、圖2及表2。

表1 PCR引物序列、產(chǎn)物片段及退火溫度Tab. 1 PCR primers, product sizes, and annealing temperatures

表2 不同濃度TGF-β1刺激48 h NRK-49F表達Vimentin、α-SMA的平均熒光強度Tab. 2 Vimentin, α-SMA average fl uorescence intensity in NRK-49F after TGF-β1 stimulus ()

表2 不同濃度TGF-β1刺激48 h NRK-49F表達Vimentin、α-SMA的平均熒光強度Tab. 2 Vimentin, α-SMA average fl uorescence intensity in NRK-49F after TGF-β1 stimulus ()

aP＜0.05, bP＜0.01, vs control group (0 ng/ml)

0.5 1 2 5 10 Vimentin 107.0±23.38 62.48±5.94a 39.70±7.91b 30.55±2.6b 26.56±3.38b 16.37±3.28b α-SMA 9.40±4.62 13.96±2.67a 21.67±2.67b 40.05±5.67b 71.67±4.12b 109.3±29.67b TGF-β1（ng/ml）0

2 細胞上清FN濃度 在＞1 ng/ml濃度TGF-β1刺激下，NRK-49F細胞上清FN的濃度顯著升高(P均＜0.01)。并且，細胞上清FN的含量與TGF-β1的刺激濃度呈正相關(R=0.966，P＜0.01)。見表3。

表3 不同濃度TGF-β1刺激NRK-49F細胞上清FN含量Tab. 3 Concentration of FN in supernatant after TGF-β1 stimulus

3 不同濃度TGF-β1對細胞MMP-9表達的影響應用Western blot方法，檢測TGF-β1刺激48 h各組細胞MMP-9蛋白表達水平，正常NRK-49F細胞有基礎的MMP-9表達，加入＜2 ng/ml濃度TGF-β1刺激后，細胞MMP-9蛋白表達無明顯改變。以＞5 ng/ml濃度刺激時，MMP-9表達有下降的趨勢，但各組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見圖3。Northern blotting檢測各組細胞MMP-9 mRNA的表達，正常細胞有基礎的MMP-9表達，當0.5 ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml TGF-β1刺激后，其表達有所升高，但＞5 ng/ml刺激濃度組，MMP-9表達逐漸減少，10 ng/ml時最低(較0 ng/ml組約下降10%)，但各組之間差異也無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見圖4。

4 不同濃度TGF-β1對細胞TIMP-1表達的影響Western blot檢測TGF-β1刺激48 h各組細胞TIMP-1的蛋白表達，NRK-49F細胞TIMP-1蛋白表達量呈濃度相關性(R=0.9673，P＜0.05)。濃度＞2 ng/ml的刺激劑量，其表達量分別是0 ng/ml組的1.33、1.5、1.79倍(P＜0.05或P＜0.01)。見圖5。Northern blotting檢測各組細胞TIMP-1 mRNA表達，正常細胞有一定的TIMP-1 mRNA的表達，隨著TGF-β1刺激濃度的增加，TIMP-1 mRNA的表達逐漸增多，在2 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml 3種濃度刺激下，其表達分別與0 ng/ml組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，10 ng/ml較0 ng/ml組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。見圖6。

討 論

腎間質(zhì)纖維化是終末期腎功能衰竭的共同病理表現(xiàn)，其主要特征是間質(zhì)成纖維細胞的異常增殖和細胞外基質(zhì)的過度積聚[9]。FBS是腎間質(zhì)的固有細胞，生理狀態(tài)下數(shù)量較少，約占腎組織細胞總數(shù)的12%，而在纖維化狀態(tài)下比例可增加到30%甚至達60%[10-11]。成纖維細胞持續(xù)激活轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞是導致腎間質(zhì)纖維化重要環(huán)節(jié)[12]。有文獻報道，激活的MFB可以產(chǎn)生永久的促增殖活性和促ECM的合成能力，因此，MFB數(shù)量的多少與間質(zhì)纖維化輕重程度密切相關[13-14]。MFB形態(tài)上是一類同時具有平滑肌和成纖維細胞特性的細胞，具有強于FBS數(shù)倍的增殖能力和合成ECM如膠原、糖蛋白和蛋白多糖等的能力，在病理狀態(tài)下，是產(chǎn)生細胞外基質(zhì)的主要來源細胞，分化增殖后的成纖維細胞首先分泌出纖維連接蛋白，為其他ECM的形成提供一個支架。

圖 1 不同濃度TGF-β1對NRK-49F表達Vimentin的影響(×600)Fig. 1 Vimentin fluorescence stained in NRK-49F after TGF-β1 stimulus(×600)

圖 2 不同濃度TGF-β1對NRK-49F表達α-SMA的影響(×600)Fig. 2 α-SMA fluorescence stained in NRK-49F after TGF-β1 stimulus(×600)

圖 3 不同濃度TGF-β1刺激49F細胞表達MMP-9蛋白印跡結(jié)果A為MMP-9的Western blot結(jié)果；B為MMP-9蛋白表達的相對水平(MMP-9/β-actin的吸光度比值)Fig. 3 Expressions of MMP-1 after TGF-β1 stimulus A: Westernblot showing MMP-9 B: MMP-9/β-actina：0 ng/ml group； b：0.5 ng/ml group； c：1 ng/ml group；d：2 ng/ml group； e：5 ng/ml group； f：10 ng/ml group

圖 4 不同濃度TGF-β1刺激49F細胞表達MMP-9mRNA的結(jié)果A為MMP-9的Northern blotting；B為MMP-9表達的相對灰度值（MMP-9/28s吸光度比值）Fig. 4 Expressions of MMP-9 mRNA after TGF-β1 stimulusA: Northern blot showing MMP-9 B: MMP-9/28sa：0 ng/ml group； b：0.5 ng/ml group； c：1 ng/ml group；d：2 ng/ml group； e：5 ng/ml group； f：10 ng/ml group

圖 5 不同濃度TGF-β1刺激49F細胞表達TIMP-1蛋白印跡結(jié)果A為TIMP-1的Western blot；B為TIMP-1蛋白表達的相對灰度值（TIMP-1/β-actin吸光度比值）Fig. 5 Expressions of TIMP-1 after TGF-β1 stimulus A: Western blot showing TIMP-1; B: TIMP-1/β-actin a：0 ng/ml group；b：0.5 ng/ml group；c：1 ng/ml group；d：2 ng/ml group；e：5 ng/ml group；f：10 ng/ml group

圖 6 不同濃度TGF-β1刺激49F細胞表達TIMP-1 mRNA的結(jié)果A為TIMP-1的Northern blotting；B為TIMP-1表達的相對灰度值(TIMP-1/28s吸光度比值)Fig. 6 Expressions of TIMP-1 mRNA after TGF-β1 stimulusA: Northern blot showing TIMP-1; B: TIMP-1/28sa：0 ng/ml group；b：0.5 ng/ml group；c：1 ng/ml group；d：2 ng/ml group；e：5 ng/ml group；f：10 ng/ml group

與Yang等[15]報道一致，本實驗發(fā)現(xiàn)，對體外培養(yǎng)的大鼠腎間質(zhì)成纖維細胞給予不同濃度的TGF-β1刺激，隨著TGF-β1刺激濃度的逐漸升高(0.5 ～ 10 ng/ml)，成纖維細胞原表型標記物Vimentin表達迅速下降，在10 ng/ml濃度時Vimentin的表達幾乎全部消失；而與之相反，肌成纖維細胞表型標志α-SMA表達逐漸增多。實驗證實了TGF-β1體外確能誘導大鼠腎間質(zhì)成纖維細胞激活發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，其被激活的程度依賴TGF-β1的刺激濃度。同時，與細胞表達α-SMA的水平上調(diào)同步，隨著TGF-β1刺激濃度的增高，細胞分泌FN逐漸增多，與刺激濃度呈正相關。說明TGF-β1刺激腎間質(zhì)成纖維細胞的激活后，隨著轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞的增多，其合成、分泌細胞外基質(zhì)也增加。

已知調(diào)控細胞外基質(zhì)代謝的酶類MMPs/TIMPs系統(tǒng)對ECM的降解起著極為重要的作用[16]。其中明膠酶B主要由成纖維細胞、單核-巨嗜細胞等產(chǎn)生，在體內(nèi)外能降解包括纖維連接蛋白、膠原、明膠在內(nèi)的多種ECM蛋白成分。MMP-9的降解潛能受內(nèi)源性特異性TIMP-1的抑制。目前發(fā)現(xiàn)TGF-β1能調(diào)控MMPs及TIMPs的基因表達，從而調(diào)節(jié)ECM的降解與重建[4]。但TGF-β1對不同的細胞MMPs及TIMPs的調(diào)控效應不同：如在人表皮成纖維細胞中加入TGF-β1刺激MMP-9的表達，對人羊膜細胞則抑制MMP-9、促進TIMP-1的表達，但目前對腎間質(zhì)成纖維細胞的影響研究較少[17-18]。

本實驗結(jié)果表明，TGF-β1在體外顯著上調(diào)TIMP-1的基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)的合成，而對MMP-9表達的影響并不明顯。雖然Martin等[19]發(fā)現(xiàn)TGF-β1體外同時上調(diào)了人腎小球上皮細胞的MMP-2、MMP-9和TIMP-1的表達，但MMP-9/TIMP-1的比值降低與本實驗結(jié)果一致。我們分析認為，細胞外基質(zhì)FN的增多可能與TGF-β1激活間質(zhì)成纖維細胞并顯著上調(diào)了TIMP-1的表達，導致FN降解減少有關。

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Effects of TGF-β1activating renal interstitial fibroblast cells on MMP-9 and TIMP-1 expression

ZHOU Jin , CHEN Xiang-mei, LIU Shu-wen, FU Bo, FENG Zhe, HONG Quan
Department of Nephrology, Kidney Institute of Chinese PLA General Hospital, State Key Laboratory of Kidney Disease, Beijing 100853, China
The fi rst author: ZHOU Jin. Email: wangy631@126.com

Objective To study the changes on MMP-9 and TMP-1 expression when renal interstitial fibroblast cells (NRK-49F)occurred phenotypic transform induced by transforming growth factor beta-1 (TGF-β1), and its effects on the secretion of fibronectin(FN).MethodsRenal interstitial fi broblast cells (NRK-49F) of rats were stimulated by hTGF-β1at different concentrations of 0 ng/ml,0.5 ng/ml, 1 ng/ml, 2 ng/ml, 5ng/ml, 10 ng/ml. Immune fl uorescence was used to measure the expression of cell phenotype sign α-SMA and Vimentin, and ELISA was used to detect the concentration of FN in supernatant, while Western Blot and Northern Blotting technique was used to measure the expression of MMP-9 and TIMP-1. Results TGF-β1at the concentration of 0.5 ng/ml -10 ng/ml induced the expression of α-SMA which represented myo fi broblast appearance, with increasing concentration of TGF-β1, the expression of α-SMA gradually increased and Vimentin decreased signi fi cantly, furthermore FN secretion were driven up greatly (P＜0.05 or P＜0.01), while TGF-β1 at the concentration of 2 ng/ml markly drove up the expression of TIMP-1 mRNA and protein(P＜0.05 or P＜0.01) , those effects showed concentration-dependent form. However, TGF-β1at above concentration had no remarkable effect on MMP-9 mRNA and protein expression (P＞ 0.05). Conclusion TGF-β1can induce renal interstitial fi broblast activation to be myo fi broblast, and promote fi bronectin secretion, whose effects may be related to up-regulation of TIMP-1 expression so as to restrain ECM decompounded.

TGF-β1; renal interstitional fi broblast; phenotype-differentiation α-smooth muscle actin; fi bronectin; MMP-9; TIMP-1

R 34

A

2095-5227(2014)05-0449-06

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.05.015

時間：2014-03-20 09:16

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140320.0916.004.html

2014-02-10

國家自然科學基金項目(30130220；30873345)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(30930092;30873345)

周瑾，女，博士，出站博士后，副主任醫(yī)師。研究方向：腎臟病的中西醫(yī)結(jié)合臨床及基礎研究。Email: wangy631@126.com