秦新英，李瑞

（1.河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北省化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071002；

2.固廢資源化利用與節(jié)能建材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100041）

基于8-氨基1，3，6-萘三磺酸二鈉鹽的糖基化蛋白質(zhì)標(biāo)記方法

秦新英1，李瑞2

（1.河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北省化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071002；

2.固廢資源化利用與節(jié)能建材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100041）

發(fā)展了基于熒光試劑8-氨基1，3，6-萘三磺酸二鈉鹽（ANTS）的糖基化蛋白質(zhì)選擇性標(biāo)記和熒光檢測(cè)的新方法.實(shí)驗(yàn)中以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)細(xì)胞色素c和核糖核酸酶b為樣品，優(yōu)化了pH和反應(yīng)時(shí)間.在優(yōu)化的條件下，核糖核酸酶b的檢測(cè)靈敏度可提高22倍，而非特異性的標(biāo)記僅為1%，顯示了這種衍生方法極好的選擇性.進(jìn)一步將該方法應(yīng)用于卵清蛋白的衍生，通過(guò)結(jié)合二氧化鈦（TiO2）親和富集，共鑒定到14個(gè)蛋白質(zhì)，其中超過(guò)85%的蛋白質(zhì)具有一致的N-X-T／S（X為除脯氨酸以外的其他氨基酸）序列，為潛在的糖基化蛋白，進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法的高選擇性.

8-氨基1，3，6-萘三磺酸二鈉鹽；糖基化蛋白質(zhì)；標(biāo)記；熒光檢測(cè)

糖基化蛋白質(zhì)是一種重要的翻譯后修飾蛋白質(zhì)，在生命體中發(fā)揮著重要的作用.糖基化蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化與多種癌癥的發(fā)生息息相關(guān)，使得許多種糖基化蛋白質(zhì)成為癌癥診斷和治療的重要靶點(diǎn)［1－3］.因此，實(shí)現(xiàn)有效和靈敏的糖基化蛋白質(zhì)檢測(cè)具有重要的意義.

熒光檢測(cè)是目前最為靈敏的檢測(cè)方式之一，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)中的諸多領(lǐng)域，實(shí)現(xiàn)了改進(jìn)的生物分子檢測(cè)效率［4］.例如，Qiao［5］等將水溶性的磺酸-3-氫-吲哚菁染料sb-cy3-NHS應(yīng)用于蛋白質(zhì)的衍生和熒光檢測(cè)，牛血清白蛋白的檢測(cè)限可降低到12.8nmol／L，與采用常用的熒光試劑苯異硫氰酸酯衍生后的檢測(cè)限相比可降低約100倍，顯著地提高了蛋白質(zhì)的檢測(cè)靈敏度.在糖基化蛋白質(zhì)研究中，熒光衍生技術(shù)多用于糖基化蛋白中釋放的寡糖的衍生和檢測(cè)［6］，而糖基化蛋白質(zhì)的選擇性衍生和檢測(cè)的技術(shù)尚未見(jiàn)報(bào)道.

8-氨基-1，3，6-萘三磺酸二鈉鹽（ANTS）是經(jīng)典的多糖熒光標(biāo)記試劑［7］，本文初步嘗試將ANTS應(yīng)用于糖基化蛋白質(zhì)的衍生，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜樣品中糖基化蛋白質(zhì)的選擇性衍生和靈敏的熒光檢測(cè).該方法有望為后續(xù)深入的糖基化蛋白質(zhì)研究提供新途徑.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

ANTS、細(xì)胞色素c、核糖核酸酶b、伴清蛋白均購(gòu)自于Sigma（St.Louis，MO，USA）.TiO2購(gòu)自GL（Tokyo，Japan）.三氟乙酸（TFA）和氰基硼氫化鈉（NaCNBH3）均購(gòu)于Acros Organics（Geel，Belgium）.高碘酸鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán).色譜純乙腈（ACN）購(gòu)自Merck（Darmstadt，Germany）.所有無(wú)機(jī)試劑均為分析純，而其他試劑均為色譜純.實(shí)驗(yàn)中用水采用Milli-Q系統(tǒng)（Millipore，Bedford，USA）純化制得.

1.2 蛋白質(zhì)衍生

代表性的蛋白質(zhì)衍生過(guò)程如圖1所示.具體如下，取10μL 50mg／mL卵清蛋白（溶解于100mmol／L乙酸-乙酸鈉，150mmol／L氯化鈉，pH 5.0），加入5μL 40mol／L高碘酸鈉（溶解于100mol／L乙酸-乙酸鈉，150mmol／L氯化鈉，pH 5.0），于25℃避光振蕩反應(yīng)30min，然后加入10μL 80mmol／L亞硫酸鈉（溶解于100mmol／L乙酸-乙酸鈉，150mmol／L氯化鈉，pH 5.0），繼續(xù)于25℃反應(yīng)10min，從而消除過(guò)量的高碘酸鈉.再加入50μL 0.5mg／50μL ANTS（溶解于100mmol／L 乙酸-乙酸鈉，pH 6.0），混勻后加入10μL新鮮配制的1.0mol／L NaCNBH3（溶解于二甲亞砜），25℃反應(yīng)2h，從而實(shí)現(xiàn)糖基化蛋白質(zhì)的標(biāo)記.反應(yīng)完畢，待進(jìn)樣分析.

1.3 HPLC分析

HPLC測(cè)定在包含進(jìn)樣閥（Rheodyne，Cotati，CA，USA）、配備四元梯度單元的智能色譜泵（Jasco，Tokyo，Japan）、智能熒光檢測(cè)器（Jasco，Tokyo，Japan）和紫外檢測(cè)器（大連依利特分析儀器有限公司）組成的色譜系統(tǒng)中進(jìn)行，色譜柱為C8柱（250×4.6mm，5μm，30nm）.流動(dòng)相A為純水（含體積分?jǐn)?shù)0.1% TFA），流動(dòng)相B為95%的ACN（含0.1%TFA）.熒光檢測(cè)激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為360nm和515nm，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm.單個(gè)蛋白質(zhì)分析梯度如下：0～30min，10%～70%B；流速：1mL／min.蛋白質(zhì)混合物分離梯度：0～35min，10%～80%B；35～40min，80%～80%B；流速：1mL／min.卵清蛋白質(zhì)分離梯度：0～60min，10%～80%B；60～80min，80%～80%B；流速，0.5mL／min.

圖1 糖基化蛋白質(zhì)衍生示意Fig.1 Schematic diagram of glycoprotein derivatization

2 結(jié)果與討論

2.1 pH對(duì)衍生反應(yīng)的影響

實(shí)驗(yàn)中選擇了2個(gè)代表性的蛋白：核糖核酸酶b和細(xì)胞色素c.核糖核酸酶b是典型的糖蛋白，而細(xì)胞色素c是典型的非糖蛋白.實(shí)驗(yàn)中以二者質(zhì)量濃度比為1∶1的蛋白混合物考察了反應(yīng)pH對(duì)衍生化的影響.共考察了7個(gè)pH，分別是4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0和10.0的緩沖體系.圖2為核糖核酸酶b的相對(duì)峰面積以及細(xì)胞色素c和核糖核酸酶b的峰面積比隨衍生反應(yīng)pH變化趨勢(shì)圖，當(dāng)衍生體系的pH為6.0時(shí)，細(xì)胞色素c與核糖核酸酶b的面積比值為最小，說(shuō)明此時(shí)副反應(yīng)系數(shù)最小，二者的比值為0.114，可以更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)糖蛋白的衍生；從圖2中還可以看出，體系的pH越小，糖蛋白的衍生效果越好，但是pH太低時(shí)，會(huì)影響蛋白質(zhì)的溶解性，因此最終選擇pH為6.0.

圖2 pH對(duì)核糖核酸酶b和細(xì)胞色素c的衍生效果的影響Fig.2 Effect of pH of buffer on the derivatization of ribonuclease b and cytochrome c

2.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)衍生反應(yīng)的影響

進(jìn)一步考察了衍生反應(yīng)時(shí)間對(duì)衍生效果的影響，核糖核酸酶b的相對(duì)峰面積以及細(xì)胞色素c和核糖核酸酶b的峰面積比隨衍生反應(yīng)時(shí)間的變化趨勢(shì)如圖3所示.隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，核糖核酸酶b的峰面積逐漸增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)2h后，峰面積趨于穩(wěn)定；細(xì)胞色素c和核糖核酸酶b峰面積比在反應(yīng)時(shí)間1min時(shí)最大，以后顯著降低，并隨著衍生反應(yīng)時(shí)間的增加副反應(yīng)逐漸增加.當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為2h時(shí)，核糖核酸酶b的峰面積達(dá)到最大峰面積的96%，并且在此時(shí)細(xì)胞色素c和核糖核酸酶b的峰面積比值較小且趨于穩(wěn)定，僅為3.6%，因此反應(yīng)時(shí)間最終選擇為2h.

2.3 單個(gè)糖蛋白質(zhì)衍生

在優(yōu)化的衍生條件下，以典型的糖蛋白核糖核酸酶b為模式蛋白，考察了熒光試劑ANTS的衍生效果.由于熒光試劑ANTS只與糖蛋白糖鏈氧化后形成的醛基反應(yīng)，因此在衍生過(guò)程中若去掉氧化步驟，便可檢測(cè)吸附等非特異性標(biāo)記.因此實(shí)驗(yàn)中比較了0.22mg／mL核糖核酸酶b進(jìn)樣10μL在3種情況下的色譜分離結(jié)果：第一，糖鏈氧化，熒光試劑ANTS標(biāo)記，熒光檢測(cè)，如圖4a；第二，糖鏈不氧化，加入ANTS做空白實(shí)驗(yàn)，熒光檢測(cè)，如圖4b；第三，直接進(jìn)樣分析，紫外檢測(cè)，如圖4c.由圖可知，對(duì)于單個(gè)核糖核酸酶b來(lái)說(shuō)，通過(guò)選擇性糖鏈標(biāo)記，其檢測(cè)靈敏度與紫外檢測(cè)相比提高了22倍，而非特異性的標(biāo)記僅占了1%，顯示了這種衍生方法極好的選擇性.

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)核糖核酸酶b和細(xì)胞色素c衍生效果的影響Fig.3 Effect of reaction time on the derivatization of ribonuclease b and cytochrome c

圖4 核糖核酸酶b經(jīng)ANTS標(biāo)記熒光檢測(cè)a、熒光空白實(shí)驗(yàn)b和紫外檢測(cè)c的色譜Fig.4 Chromatograms of ANTS labeled ribonuclease b with fluorescent detection a，fluorescence blank b，and UV-visible blank c

2.4 衍生蛋白質(zhì)混合物

筆者進(jìn)一步將ANTS應(yīng)用于了蛋白質(zhì)混合物的衍生.共選擇3個(gè)蛋白質(zhì)，其中包括2個(gè)糖蛋白：核糖核酸酶b和伴清蛋白；1個(gè)非糖蛋白：細(xì)胞色素c.熒光試劑ANTS只能選擇性與糖蛋白質(zhì)中多糖氧化后形成的醛基反應(yīng)，因此理論上，通過(guò)ANTS標(biāo)記和熒光檢測(cè)應(yīng)該僅有2個(gè)色譜峰（分別代表糖核酸酶b和伴清蛋白）實(shí)現(xiàn)有效識(shí)別.如圖5a所示，只有核糖核酸酶b和伴清蛋白在熒光下得到了檢測(cè)；而細(xì)胞色素c為非糖蛋白不可能在熒光檢測(cè)下有響應(yīng)信號(hào)，進(jìn)一步說(shuō)明了筆者發(fā)展的方法具有很好的選擇性.

2.5 選擇性卵清蛋白衍生

進(jìn)一步將該方法應(yīng)用于卵清蛋白提取產(chǎn)物的分析.如圖6所示，經(jīng)過(guò)ANTS標(biāo)記后，熒光檢測(cè)和紫外對(duì)照相比選擇性有很大的差異，其中熒光檢測(cè)靈敏的色譜峰筆者認(rèn)為是糖蛋白.為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，將衍生的蛋白質(zhì)混合物用TiO2進(jìn)行捕集，并采用微柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行了鑒定，共鑒定到14個(gè)蛋白質(zhì)，其中，53%的蛋白質(zhì)是已知的糖基化蛋白質(zhì)，而超過(guò)85%的蛋白質(zhì)具有一致的N-X-T／S（X為除脯氨酸以外的氨基酸）序列，因此它們是潛在的糖基化蛋白.以上結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了方法的高選擇性.

圖5 ANTS標(biāo)記3種蛋白質(zhì)混合物熒光檢測(cè)a和紫外檢測(cè)b色譜.Fig.5 Chromatograms of ANTS labeled 3-protein mixture with fluorescent detection a，and UV-visible blank b

圖6 ANTS標(biāo)記卵清蛋白熒光檢測(cè)a和紫外檢測(cè)對(duì)照b色譜Fig.6 Chromatograms of ANTS labeled egg white proteins with fluorescent detection a and UV-visible control b

3 結(jié)論

發(fā)展了一種選擇性糖基化蛋白質(zhì)衍生和熒光檢測(cè)的新方法.糖基化蛋白質(zhì)多糖經(jīng)氧化后形成的醛基在NaCNBH3存在條件下便可選擇性與熒光試劑ANTS結(jié)合，實(shí)現(xiàn)選擇性的糖蛋白標(biāo)記和熒光檢測(cè).在優(yōu)化的衍生條件下，將該方法應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合物和卵清蛋白的衍生，實(shí)現(xiàn)了高選擇性的糖基化蛋白質(zhì)衍生，有望在糖基化蛋白質(zhì)選擇性識(shí)別領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用.

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（責(zé)任編輯：梁俊紅）

Research on 8-aminonaphthalene 1，3，6-trisulfonic acid disodium salt based fluorescent tag for selective glycoprotein labeling

QIN Xinying1，LI Rui2
（1.Chemical Biology Key Laboratory of Hebei Province，College of Chemistry and Environmental Science，Hebei University，Baoding 071002，China；2.State Key Laboratory of Solid Waste Reuse for Building Materials，Beijing 100041，China）

The selective glycoprotein labeling method based on fluorescent tag 8-aminonaphthalene-1，3，6-trisulfonic acid disodium（ANTS）was developed in the present work.With proteins cytochrome c and ribonuclease b as the samples，the pH value and reaction time were optimized.The fluorescent detection sensitivity of glycoprotein ribonuclease b could be increased about 22-fold via ANTS labeling while the nonspecific labeling only 1%，indicating the good selectivity of the developed method.The method was further used for derivatization of egg white proteins.By combining with titanium dioxide（TiO2）for glycoproteins enrichment，totally 14proteins were identified，of which 85%proteins were recognized with the sequence N-X-T／S（X except Pro），as the potential glycoproteins，which further indicated the high selectivity of the developed method.All these results suggested the potential merits of the developed method for high specific glycoprotein recognition.

book=34,ebook=55

8-aminonaphthalene-1，3，6-trisulfonic acid disodium；glycoprotein；labeling；fluorescent detection

秦新英（1978-），男，河北邯鄲人，河北大學(xué)副教授，主要從事分析化學(xué)研究.E-mail：hbuqinxinying＠163.com

O658

A

1000 -1565（2014）05 -0497 -05

10.3969／j.issn.1000 -1565.2014.05.010

2014 -05 -20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21205027）；河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（B2012201052）；河北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展項(xiàng)目（QN2014066）