羥基喜樹堿殼聚糖納米凍干粉的制備及表征

譚歡歡，邢志華，沈 云，張秀娟，，任君剛，張文君

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心生物安全評價研究所，哈爾濱150076;2.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱150076)

羥基喜樹堿(hydroxycamptothecin，HCPT)是從我國特有的珙桐科喬木—喜樹的樹干、樹皮和果實中提取的一種具有抗腫瘤作用的生物堿［1］，為細胞周期特異性藥物，主要作用于S期細胞，對G1、G2與M期細胞也有輕度的殺傷作用.近年研究發(fā)現(xiàn)，羥基喜樹堿對DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅰ(TOPOⅠ)具有靶向的選擇性抑制作用，DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅰ催化超螺旋化DNA解旋而進行復(fù)制及轉(zhuǎn)錄.羥基喜樹堿還能通過抑制TOPOⅠ而抑制癌細胞的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄［2－3］.該藥物與其他常用的抗癌藥無交叉耐藥，抗瘤譜廣，經(jīng)多年臨床療效觀察，療效確切.但是由于水溶性差以及生理學(xué)上可接受的有機溶劑不多，臨床上HCPT多以開環(huán)形式的鈉鹽注射液或者粉針劑型應(yīng)用，開環(huán)形式的HCPT會導(dǎo)致藥物療效的降低并使藥物毒副作用增大［4－8］.科研人員為提高羥基喜樹堿的抗腫瘤活性，降低毒副作用，研制了多種劑型［9－14］.本課題組在原有的工作基礎(chǔ)上［15－16］，以羥基喜樹堿、葉酸、殼聚糖、三聚磷酸鈉為原料，以葡萄糖和甘露醇為保護劑，應(yīng)用冷凍干燥技術(shù)，制備載羥基喜樹堿的葉酸－殼聚糖納米粒凍干粉.以凍干粉的外觀及在水中再分散性為指標，考察保護劑種類及其體積分數(shù)，保護劑的量和保護劑的加入方式對凍干粉的影響，以期制備出能應(yīng)用于臨床的具有靶向、緩釋作用的羥基喜樹堿凍干粉針劑.

1 材料

1.1 儀器

79－2型雙向磁力攪拌器(江蘇省金壇市榮華儀器有限公司);BS110S電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司);MDF－192超低溫冰箱(三洋公司);MCFD5508西蒙冷凍干燥機(SIM－西蒙國際);H－7650透射電子顯微鏡(日立公司);Quanta 200掃描電子顯微鏡(荷蘭FEI公司).

1.2 藥 品

葉酸(質(zhì)量分數(shù)99.08%，Sigma);殼聚糖(脫乙酰度＞95%，濟南海得貝海洋生物工程有限公司);羥基喜樹堿(上海源葉生物科技有限公司);三聚磷酸鈉(青島海洋化工有限公司);葡萄糖(99.9%，天津生化試劑廠)、甘露醇(99.9%，天津天新精細化工開發(fā)中心);其他試劑均為分析純.

2 方法

2.1 載羥基喜樹堿的葉酸－殼聚糖納米粒水分散體系的制備［16］

準確稱取葉酸(FA)0.100 2g，置于100 mL燒杯中，蒸餾水混懸，滴加少量氨水溶解，置100 mL容量瓶中定容至刻度，配制成1.0 mg/mL的FA氨鹽溶液，備用.

準確稱取殼聚糖(CTS)0.400 1g，置于200 mL燒杯中，蒸餾水混懸，滴加適量冰醋酸溶解，置200 mL容量瓶中定容至刻度，配制成2.0 mg/mL的CTS醋酸溶液，然后加入40 mg HCPT，均勻混懸于CTS醋酸溶液中，備用.

準確稱取三聚磷酸鈉(TPP)0.200 0g，置于100 mL燒杯中，蒸餾水溶解，置100 mL容量瓶中定容至刻度，配制成2.0 mg/mL的TPP溶液，備用.

在磁力攪拌(900 r/min)作用下，向200 mL2.0 mg/mL的CTS醋酸溶液中滴加1.0 mg/mL的FA氨鹽溶液50 mL，滴速為1滴/s，然后滴入2.0 mg/mL的TPP溶液20 mL，滴速仍為1滴/s.滴加完畢，繼續(xù)攪拌10 min即得到載羥基喜樹堿的葉酸－殼聚糖(FA－CTS/HCPT)納米粒水分散體系，備用.

2.2 FA－CTS/HCPT納米粒凍干粉制備因素考察

2.2.1 保護劑及其體積分數(shù)對凍干的影響

取葡萄糖和甘露醇適量，用蒸餾水溶解，分別配制成體積分數(shù)為2%、4%、8%、10%、16%的葡萄糖和甘露醇溶液備用.準確量取“2.1”項下的FA－CTS/HCPT水分散體系3 mL，向其中分別加入上述甘露醇和葡萄糖溶液3 mL，輕輕振蕩，混合均勻，轉(zhuǎn)移至15 mL西林瓶中，同時以6 mL不添加任何保護劑的水分散體系作為對照.將西林瓶敞口，在－82°C條件下預(yù)凍24 h后，迅速置于冷凍干燥機進行真空冷凍干燥24 h.樣品凍干后，取出，蓋好瓶塞，觀察外觀，測試再分散性.

2.2.2 保護劑的量對凍干的影響

取FA －CTS/HCPT水分散體系和“2.2.1”中的不同體積分數(shù)的保護劑溶液，按照體積比為1∶1、1∶2和2∶1的比例混合，輕輕振搖，混合均勻，置于15 mL 西林瓶中，凍干步驟同“2.2.1”.凍干后取出，觀察外觀，測試再分散性.

2.2.3 保護劑的加入方式對凍干的影響

以甘露醇為保護劑，按照以下方法，將其加入到FA－CTS/HCPT水分散體系中:

1)外加法:量取FA－CTS/HCPT水分散體系6 mL，向其中加入10 mg甘露醇粉末，輕輕振蕩，混合均勻，置于15 mL西林瓶中，凍干步驟同“2.2.1”操作.

2)內(nèi)加法:在制備FA－CTS/HCPT納米水分散體系時，預(yù)先在CTS醋酸溶液中加入適量甘露醇粉末溶解，其他操作不變.凍干后取出，觀察外觀，測試再分散性.

2.2.4 凍干粉再分散性考察

稱取上述所制備的凍干粉0.02 g，置于10 mL西林瓶中，向其中加入蒸餾水5mL，輕輕振搖，觀察凍干粉再分散情況.

2.2.5 凍干粉微觀形態(tài)考察

選取外表光滑、未出現(xiàn)塌陷萎縮、結(jié)構(gòu)致密、再分散性好的凍干粉及未添加保護劑的凍干粉少量，加入適量蒸餾水分散成納米水分散體系，向制樣銅網(wǎng)上均勻滴兩滴，15 min后，在透射電鏡下觀察納米粒表面形態(tài)，并拍攝照片.

3 結(jié)果與討論

3.1 凍干粉外觀

3.1.1 保護劑及其體積分數(shù)對凍干粉外觀的影響向FA－CTS/HCPT納米水分散體系中加入不同體積分數(shù)的葡萄糖和甘露醇溶液，經(jīng)冷凍干燥制得凍干粉，外觀結(jié)果見表1.

表1 不同保護劑及其體積分數(shù)下的凍干品外觀

由表1可見，使用不同的保護劑及同一保護劑不同體積分數(shù)，凍干效果不同.以甘露醇為保護劑時凍干品外觀好，其中甘露醇體積分數(shù)為8%時最好:完整的餅狀，均勻的乳白色，光滑的外表，結(jié)構(gòu)致密松脆.

3.1.2 保護劑的量對凍干粉外觀的影響

將FA－CTS/HPTC水分散體系與不同體積分數(shù)甘露醇溶液，按照不同體積比混合均勻，經(jīng)冷凍干燥得到凍干粉，外觀結(jié)果見表2.

表2 保護劑的量對凍干的影響

由表2可知，保護劑加入量改變，凍干效果隨之改變.當(dāng)保護劑與水分散體系的體積相同時，凍干品的表面光滑，為完整的餅狀，結(jié)構(gòu)致密松脆，凍干效果最好.

3.1.3 保護劑的加入方式對凍干粉外觀的影響

按照外加法及內(nèi)加法，將甘露醇加入到FACTS/HPTC水分散體系中，經(jīng)冷凍干燥得到凍干粉，外觀結(jié)果見表3所示.

表3 保護劑的加入方式對凍干的影響

由表3可知，保護劑的加入方式不同，對凍干品的外觀影響較小.采用外加法和內(nèi)加法所得的凍干品均為餅狀，均勻乳白色，外表光滑結(jié)構(gòu)松脆;內(nèi)加法所得凍干品可見少量紋理，兩者的差異較小.

3.2 凍干粉再分散性

3.2.1 保護劑及其體積分數(shù)對凍干粉再分散性的影響

保護劑及其體積分數(shù)對凍干粉再分散影響結(jié)果見表4.

表4 保護劑及其體積分數(shù)對凍干粉再分散影響

由表4可知，不同保護劑及同一保護劑不同體積分數(shù)的凍干粉再分散性存在很大差異.葡萄糖溶液體積分數(shù)在8%，10%時凍干粉能夠分散，分散體系為均勻乳狀膠體，分散效果較好;甘露醇體積分數(shù)為8%、10%、16%時凍干粉能分散，其中8%的體積分數(shù)條件下，分散效果最佳.

3.2.2 保護劑的量對凍干粉再分散性的影響

保護劑的量對凍干粉再分散性的影響結(jié)果見表5.

表5 保護劑的量對凍干粉再分散性的影響

由表5可知，保護劑加入量變化，凍干粉再分散性也隨之改變.綜合考慮再分散性和節(jié)約保護劑，確定加入保護劑的體積與水分散體系的體積比為 1∶1.

3.2.3 保護劑的加入方式對凍干粉再分散影響

保護劑的加入方式對凍干粉再分散影響結(jié)果見表6.

表6 保護劑的加入方式對凍干粉再分散影響

由表6可知，保護劑的不同加入方式對凍干粉再分散性影響較大.其中，外加法所得的凍干粉再分散后沒有懸浮的不溶物，為均勻膠體溶液;內(nèi)加法有少許不溶物懸浮.分析內(nèi)加法產(chǎn)生不溶物的原因，可能為內(nèi)加甘露醇時，甘露醇占用了CTS與FA、TPP及HCPT的結(jié)合位點，使得粒徑增大，形成沉淀.

3.3 凍干粉微觀形態(tài)

凍干粉樣品的透射電鏡及掃描電鏡圖見圖1、2、3.

圖1 不同保護劑體積分數(shù)下凍干粉再分散后納米粒透射電鏡圖

圖2 不同保護劑體積分數(shù)下凍干粉復(fù)溶后透射電鏡圖—單個納米粒子

圖3 未加保護劑和加8%甘露醇保護劑的凍干粉掃描電鏡圖

由圖1、2可見，加保護劑的納米粒呈球形，粒子的大小均勻，彼此未見粘連;保護劑為8%甘露醇的納米粒形態(tài)呈球形，粒子的粒徑稍有增大，粒子間有少許粘連;保護劑為10%甘露醇納米粒呈橢球形，粒子的粒徑增大，粒子間大量團聚;保護劑為16%甘露醇納米粒呈圓球形，粒子的粒徑增大，粒子間出現(xiàn)部分團聚粘連.由此可知:保護劑為8%甘露醇再分散后透射電鏡下納米粒子形態(tài)規(guī)則，大小均勻，微觀形態(tài)較10%及16%甘露醇好.圖3為凍干粉的掃描電鏡圖，由圖可見，8%甘露醇制備的凍干粉成花瓣形，花瓣中可見球形粒子，應(yīng)為羥基喜樹堿納米粒子.

4 結(jié)語

以羥基喜樹堿、葉酸、殼聚糖、三聚磷酸鈉為原料，以葡萄糖和甘露醇為保護劑，應(yīng)用冷凍干燥技術(shù)，制備了載羥基喜樹堿的葉酸－殼聚糖納米粒凍干粉.以凍干粉的外觀及在水中再分散性為指標，考察了保護劑種類及其體積分數(shù)，保護劑的量和保護劑的加入方式對凍干粉的影響，得出最佳工藝條件如下:將8%甘露醇水溶液，等體積加入到載羥基喜樹堿的葉酸－殼聚糖納米粒水分散體系中，混合均勻，于－85℃條件下預(yù)凍24 h，再真空冷凍干燥24 h.所得凍干粉顏色均一，結(jié)構(gòu)致密松脆，在水中再分散快且好.

該條件下制備的凍干粉因含有葉酸靶向配體，平均粒徑為200 nm左右，且在水中再分散性好，對羥基喜樹堿的腫瘤靶向制劑研究，提供了理論參考.該凍干粉針劑有望成為羥基喜樹堿的新劑型.

［1］潘 晶.羥基喜樹堿的藥理作用與臨床應(yīng)用探討［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2010，23(4):142 －143.

［2］陳 菲，王瑜梅.羥基喜樹堿對人乳腺癌MCF－7細胞增殖及凋亡的影響［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，8(10):17 －19.

［3］王新偉.羥基喜樹堿膀胱灌注對淺表性膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)防作用探討［J］.中國實用醫(yī)藥，2012，7(7):170 －171.

［4］洪明凰，裴元英.羥基喜樹堿及其制劑的研究進展［J］.中國臨床藥學(xué)雜志，2008，17(4):255 －258.

［5］齊 菲.羥基喜樹堿劑型的研究進展［J］.中國藥業(yè)，2005，14(9):93－94.

［6］陳秀珍.注射羥基喜樹堿凍干粉針劑的制備方法［P］.中國:02138930.6，2002－08－15.

［7］KONO K，OZAWA T，YOSHIDA T，etal.Highly temperature－sensitive liposomesbased on a thermosensitive block copolymer for tumor － specific chemotherapy［J］.Biomaterials，2010，31(27):7096－7105.

［8］FERRANDINA G，CORRADOG，LICAMELIA，etal.Pegylated liposomal doxorubicin in the management of ovarian cancer［J］.Ther Clin Risk Manag，2010，6:463 －483.

［9］古錦輝，凌家俊，謝 毅，等.羥基喜樹堿脂質(zhì)體的制備與性質(zhì)研究［J］.北方藥學(xué)，2012，9(4):23 －24.

［10］張秀娟，柯明麗，楊 菁，等.羥基喜樹堿肝靶向脂質(zhì)體的制備與表征［J］.中國組織工程研究，2012，34(16):6339－6342.

［11］吳 泊，張馨欣，陳燕忠.羥基喜樹堿注射乳劑的制備及其滅菌穩(wěn)定性研究［J］.中國藥師，2009，12(7):867 －869.

［12］李慶勇，劉 晨，姚麗萍，等.羥基喜樹堿微粉的制備及抗腫瘤活性［J］.中國藥學(xué)雜志，2010，45(23):1831 －1836.

［13］易以木，陳秀珍.羥基喜樹堿葡聚糖納米粒的制備方法［P］.中國:01138252.X，2001－12－06.

［14］易以木，楊唐玉，吳漢強，等.羥基喜樹堿聚乳酸納米粒的制備方法［P］.中國:01133700.1，2001－11－22.

［15］邢志華.載羥基喜樹堿葉酸－殼聚糖微球制備及其緩釋性［J］.哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2012，28(4):389－392.

［16］邢志華，方桂珍，蘇 玲，等.羥基喜樹堿葉酸－殼聚糖納米粒的制備及其性能研究［J］.功能材料，2012，43(2):322－325.