同步輻射微區(qū)X射線熒光和吸收譜技術在大氣、土壤和動植物分析中的應用

袁 靜 羅立強

1（中國地質大學（北京）數(shù)理學院 北京 100083）

2（國家地質實驗測試中心 北京 100037）

大氣飄塵、土壤和動植物等是環(huán)境中毒性元素遷移轉化的重要載體，這些樣品基質復雜，異質性強，而這種內(nèi)在的異質性在元素的生物地球化學過程和行為機制中起著關鍵作用[1]，因此僅在宏觀水平測定元素的總量并不能滿足研究需要，而往往需要在微觀尺度探索元素的行為，進而獲得元素的移動性、生物有效性和毒性等信息。

同步輻射技術由于其檢測限低、靈敏度高、微區(qū)原位、無損分析等特性，在眾多微區(qū)分析技術中脫穎而出，尤其對于微尺度樣品和水合的生物樣品具有獨特優(yōu)勢。經(jīng)過三代發(fā)展，同步輻射光譜亮度達 1020ph/(S·mm2·mrad2·0.1%BW)[2]，使得靈敏度更高，不僅大大縮短了測量時間，并且能夠對常規(guī)分析手段難以測定的痕量金屬或類金屬元素進行較為理想的測定；光斑尺寸可達幾微米，空間分辨率達到納米-亞微米尺度，能夠獲得更高分辨率的圖像，并可在細胞水平上開展元素分析[3]。因此，同步輻射微區(qū)分析技術開拓了原位分析微尺度樣品或微小區(qū)域元素組分、化學形態(tài)、物質結構及其空間分布的新方法，目前已廣泛應用于環(huán)境科學[4]、地球科學[5]、生物學[6]和醫(yī)學[7]等多學科領域研究。

1 同步輻射微區(qū)分析的重要技術進展

1.1 同步輻射光源歷史

同步輻射就是高速運動的帶電粒子在磁場中做變速運動時發(fā)出的電磁輻射。1947年，Elder等在美國通用電器公司實驗室里的一臺70 MeV的同步加速器上首次觀察到“同步輻射”[8?9]。但起初這種輻射被視為一種電子能量損失的負面效應，從它作為一種不可避免的現(xiàn)實被加速器物理學家和高能物理學家所接受到如今在各個學科領域廣泛應用并仍在迅速成長的技術手段，同步輻射光源的發(fā)展，大體經(jīng)歷了三個階段。

第一個階段是從20世紀60年代中期開始的10年間，這一階段同步輻射應用的主要特點是必須與高能物理實驗同時進行，由于此時同步輻射是作為高能物理實驗時的一種不可避免的負面產(chǎn)物來應用的，也因此被稱為“寄生應用”。同步輻射應用發(fā)展迅速，第一代光源漸漸不能滿足應用的需要。第二代同步輻射光源專門為同步輻射應用而設計。

第二代光源的研制源于60年代儲存環(huán)的建成。1966年，美國威斯康星大學（麥迪遜）開始運作專用于同步輻射光源的 240 MeV電子儲存環(huán)Tantalus[10]，掀起了世界范圍內(nèi)建造同步輻射專用裝置的熱潮。第二代光源的建造約從20世紀70年代中期開始，它與第一代光源最主要的區(qū)別在于它已經(jīng)不是作為一個高能物理實驗的副產(chǎn)品，而是為同步輻射應用專門設計和建造，這個時期最重要的進展是磁鐵聚焦結構的引入得到更優(yōu)化的光源[11]。

20世紀90年代開始，迎來了同步輻射光源的第三次飛躍，第三代同步輻射光源的發(fā)展源于插入件技術的發(fā)展及應用，安裝插入件，使光斑尺寸大大減小，束流長期穩(wěn)定，發(fā)散度小于10?12弧度，同步光亮度達1016數(shù)量級[12]。

1.2 同步輻射光源裝置

同步輻射光源裝置主要分為三部分：一是光源，包括加速器，電子儲存環(huán)和插入件；二是光束線，同步輻射離開加速器后經(jīng)過各種光學元件，成為具有不同特性的光被引入到實驗站上供用戶使用；三是實驗站，每個實驗站功能各不相同，一個同步輻射裝置能夠供幾十個實驗站使用。

同步輻射裝置主要依靠各種元件改善光束性能，得到各種不同特性的光束線。常見的元件有插入件、聚焦系統(tǒng)、準直系統(tǒng)、單色器等。例如插入件波蕩器的使用可使同步輻射X射線亮度大幅度提高。又如Kirkpatrick-Baez聚焦鏡系統(tǒng)、折射透鏡或菲涅爾區(qū)板等光學元件，將光束尺寸聚焦到微米甚至亞微米范圍，從而提高橫向分辨率，這對常規(guī)微區(qū)分析技術難以分析的生物樣品組織[13]和土壤微生物[14?15]的研究非常有益。

目前世界上同步輻射裝置已建成的有60多個。其中，2009年投入使用的德國漢堡同步電子加速器PETRA III的儲存環(huán)能量高達6 GeV，目前被認為是最強的X射線源。隨著同步輻射技術的優(yōu)越性廣泛被大家認同，越來越多的小型同步輻射裝置在全世界范圍內(nèi)建造，儲存環(huán)能量從1.3?3 GeV不等，例如歐洲有：BESSYII—德國、SOLEIL—法國、DIAMOND—英國、SLS—瑞士、ALBA—西班牙、MAX IV—瑞典[16]。我國的上海光源(Shanghai Synchrotron Radiation Facility, SSRF)已于2009年5月正式投入使用，它屬于第三代中能同步輻射光源，包括一臺150 MeV電子直線加速器、一臺全能量增強器和一臺 3.5 GeV的電子儲存環(huán)，儲存環(huán)周長432m，能夠安裝60多條光束線，流強200?300 mA的電子束流[17]。

1.3 同步輻射微區(qū) X 射線熒光(μ-SXRF)和同步輻射X射線吸收譜技術(XAFS)

近20年來，隨著第三代同步輻射光源的不斷發(fā)展，同步輻射微區(qū)分析技術在各個學科領域應用不斷深入。其中，應用在環(huán)境科學領域和地球科學領域的分析技術主要有兩種：同步輻射微區(qū)X射線熒光光譜分析(Synchrotron micro-X-ray fluorescence spectroscopy, μ-SXRF)和同步輻射X射線吸收譜技術(X-ray absorption fine spectroscopy, XAFS)。

μ-SXRF和XAFS技術原理均基于光電效應(圖1)。不論是吸收還是熒光過程，都涉及到入射X射線和出射熒光的特定能量，而這些特定的能量對應的是不同原子的電子結構特征。這就是不同元素產(chǎn)生特征吸收和熒光譜的原因。

圖1 入射X射線激發(fā)吸收原子內(nèi)層電子時產(chǎn)生的光電效應，通過釋放X射線熒光或俄歇電子使激發(fā)態(tài)達到穩(wěn)定，K、L和M是內(nèi)層電子的能級[16]Fig.1 Depiction of the excitation of an atom by an X-ray photon and decay of the excited state by either X-ray fluorescence or by the Auger effect. The K, L and M are the core electron levels[16].

μ-SXRF技術是基于高通量的同步X射線照射樣品獲取熒光譜圖而對樣品進行定性或定量分析，和通過光學元件得到空間相干的高亮度微束X射線對樣品進行面掃描分析獲取樣品的元素空間分布圖。相較于傳統(tǒng)XRF，μ-SXRF主要有三項突破：一是具有更高的亮度，比傳統(tǒng)X射線管產(chǎn)生的X射線亮度大10個數(shù)量級[16,18]，再加上能量可調和低散射的特性使SR-XRF分析的靈敏度大大提高，非常有益于傳統(tǒng) XRF難以測定的痕量金屬和類金屬元素的分析[19]；并且，同步輻射源的電子束必須在超高真空的環(huán)境中，因而激發(fā)樣品的X射線束高度潔凈，光束不必穿過鈹窗或者氣體，X射線受到的吸收和污染均可減小到最低；此外，隨著近年來X射線光學的發(fā)展，大部分同步輻射裝置都配備了Kirkpatrick-Baez聚焦鏡系統(tǒng)、折射透鏡或菲涅爾區(qū)板等光學元件，使得X射線的光斑尺寸更小，甚至達到nm級，能夠獲得更高分辨率的元素空間分布圖。目前，微束X射線的分辨率大體在50 nm?20 μm之間[20]，可實現(xiàn)對生物樣品細胞或亞細胞水平的元素分布分析。這些都使得μ-SXRF技術受到眾多學科領域越來越多的研究者的歡迎。

XAFS技術是通過一定能量范圍的連續(xù)X射線掃描樣品，來獲取感興趣元素的局域結構信息[16]。吸收譜實驗的基本原理是保持樣品不動，照射樣品的X射線的能量逐漸增加，同時探測器收集熒光信號。當入射光能量接近感興趣元素的核外電子結合能時，原子對入射光的吸收逐漸增加，同時出射的熒光信號也相應增加。因此感興趣元素在每個能量點的吸收或熒光信號被探測和記錄下來形成吸收譜線[19]。一條吸收譜線通常被分為兩部分：X射線吸收近邊結構譜(X-ray absorption near-edge structure,XANES)和擴展 X射線吸收精細結構譜(Extended X-ray absorption fine structure, EXAFS) (圖2[16])，能量范圍大約為吸收邊前50 eV到吸收邊后200 eV和吸收邊至吸收邊后800 eV[18]。XANES能夠提供原子的氧化態(tài)、價態(tài)和配體的電負性等信息[21]。而EXAFS能夠提供原子的化學配位信息，如配位原子的種類、配位數(shù)和配位距離等[22?23]。XAFS對元素周期表上的每個元素都響應[24]，并且對樣品無特殊要求，研究介質從礦物到生物樣或溶液均可[16]。

圖2 孔雀石中Cu的K邊吸收譜線，分別標出了XANES和EXAFS區(qū)域[16]Fig.2 XAS spectrum of malachite [Cu2(CO3)(OH)2] showing the region of the spectrum pertinent to XANES and EXAFS[16].

2 μ-SXRF和XAFS的應用

近幾十年來，同步輻射微區(qū)分析技術一直促進著人類在微觀水平對元素行為的理解。其中，μ-SXRF和XAFS在元素分布分析和形態(tài)分析中得到了廣泛而深入的應用[25?26]，為了解元素在環(huán)境和生物體內(nèi)的遷移特征和轉化規(guī)律帶來了全新的發(fā)現(xiàn)，揭示了元素生物有效性和毒性等重要線索。大氣飄塵、土壤、植物是生態(tài)環(huán)境中元素傳遞的重要環(huán)節(jié)，而蚯蚓在土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，影響土壤中金屬元素的生物有效性，通過與土壤和植物的相互作用參與元素在生物鏈中的循環(huán)。本部分將從大氣飄塵、土壤、植物和蚯蚓四個方面總結這兩種同步輻射微區(qū)分析技術的應用。

2.1 大氣飄塵的來源分布和形態(tài)分析

近幾年，不斷增加的大氣顆粒物對生態(tài)環(huán)境和人類健康造成的危害引起了越來越多的關注。大氣顆粒物的危害程度主要取決于顆粒物大小、化學成分及有害元素的濃度[27]。顆粒物大小為2.5?10 μm，但過去的幾年中小于 2.5μm 的顆粒引起更多的關注。PM10的主要組成是C、O、N、Fe、K和Ca，而 PM2.5含有更多的重金屬[28]，可進入到支氣管和肺泡，造成呼吸系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)損傷和心血管疾病。近年來已經(jīng)有多種方法研究顆粒物的組成和形態(tài)，其中，μ-SXRF和XAFS技術由于其高靈敏度、低檢出限、微區(qū)原位和無損檢測等特點已逐漸成為研究大氣顆粒物中組成特征和元素形態(tài)的理想工具。

大氣顆粒物的單顆粒的μ-SXRF譜特征是研究顆粒物來源的重要指紋信息，因此可通過 μ-SXRF分析識別顆粒物的來源[29?31]。Yue 等[31]用 μ-SXRF對上海市三個監(jiān)測點的PM2.5樣品進行探測，共識別出7種來源：冶金工業(yè)塵(18%)、汽車尾氣(14%)、土壤塵(11%)、燃煤煙塵(9%)、柴油機排氣(7%)、石油燃燒氣(2%)和摩托車排氣(1%)，通過對大量顆粒物統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)冶金工業(yè)塵、汽車尾氣和燃煤煙塵是上海市 PM2.5的主要來源。Walker等[30]用10μm的光斑在17.479 keV能量處對加拿大渥太華一戶城市居民家中活動區(qū)域灰塵、家長臥室灰塵、兒童臥室灰塵和花園土壤四種樣品進行μ-SXRF面掃描，并對圖中感興趣點進行探測，結果顯示，樣品中有 S、Cl、K、Ca、Ti、Cr、Mn、Fe、Ni、Cu、Zn、As、Pb、Br、Rb和 Sr。并且與同一城市的其他家庭相比，家長臥室灰塵、兒童臥室灰塵、花園土壤樣品中的Pb和Zn含量較高，兒童臥室灰塵樣品中Cu的含量較高，活動區(qū)域灰塵樣品As的含量較高。對這些樣品進行來源分析，結果表明臥室灰塵中Pb、Zn和Ba的主要來源是顏料中的鉛白和立德粉，可能與家庭的裝修活動有關。以上研究均顯示，μ-SXRF分析已經(jīng)成為大氣顆粒物源解析的快速有效手段。

XANES技術能夠對大氣顆粒物中元素形態(tài)進行分析，用以判斷元素形態(tài)及毒性信息。Jiang等[32]選用美國國家標準與技術研究所的兩種標樣：城市灰塵(SRM 1649a)和室內(nèi)灰塵(SRM 2584)作為樣品，用XANES技術對其進行Pb L-edge、Mn K-edge、Cr K-edge分析，研究這三種元素在城市灰塵和室內(nèi)灰塵中的存在形態(tài)。與三種元素標樣吸收譜圖進行比對(圖3)并用已有標樣進行線性擬合，結果顯示，城市灰塵的Pb L-edge譜線與PbSO4相似，擬合結果是由 PbSO4(61%)和 2PbCO3·Pb(OH)2(39%)組成，室內(nèi)灰塵由 2PbCO3·Pb(OH)2(98.5%)和 PbSO4(1.5%)組成。由此可直觀地觀察到 Pb在兩種灰塵中主要的存在形態(tài)。同樣的，也可準確地觀察到Mn和Cr的存在形態(tài)。

圖3 城市灰塵(SRM 1649a)和室內(nèi)灰塵(SRM 2584)與純Pb化合物的Pb L-edge XANES譜圖(a)、城市灰塵(SRM 1649a)和室內(nèi)灰塵(SRM 2584)與純Mn化合物的Mn K-edge XANES譜圖(b)、城市灰塵(SRM 1649a)和室內(nèi)灰塵(SRM 2584)與純Cr化合物的Cr K-edge XANES譜圖(c)[32]Fig.3 Lead L-edge XANES spectra of the urban dust (SRM 1649a) and the indoor dust (SRM 2584) accompanied by the spectra of pure Pb chemical compounds in the increasing order of the Pb oxidation states (a), manganese K-edge XANES spectra of SRM 1649a and SRM 2584 as compared with spectra of pure Mn compounds (b) and chromium K-edge XANES spectra obtained from SRM 1649a and SRM 2584 compared with spectra of pure Cr compounds (c)[32].

μ-SXRF和XAFS技術在大氣顆粒物研究中的應用，展示了該技術在大氣顆粒物等微尺度樣品研究中的巨大潛力。大氣顆粒物的研究者們期待同步輻射微區(qū)分析技術在未來的幾年中，不斷推進此領域的發(fā)展。

2.2 土壤和沉積物中的元素分布與形態(tài)研究

同步輻射微區(qū)分析技術能夠對土壤中礦物組合、元素分布進行原位分析，并能進行土壤孔隙中的細節(jié)分析及與微生物的相互作用等研究，分析過程方便快捷，不需樣品前處理，很好地克服了以往測定土壤和沉積物中元素的局限，為土壤和沉積物中的元素測定提供了非常好的方法。特別是同步輻射技術空間分辨的特點使土壤中金屬形態(tài)的研究發(fā)生了巨大變化[33]。例如μ-SXRF由于其高亮度、高度聚焦和快速發(fā)展的探測技術，使其能夠在高分辨下原位分析土壤，保持土壤的自然屬性。此外，還能夠與XAFS和XRD等其他同步輻射技術聯(lián)用，在研究土壤中元素分布的同時，還能夠在3D水平測定污染元素或營養(yǎng)元素的化學形態(tài)，從而揭示元素的遷移轉化機制、生物有效性、毒性及其在環(huán)境中的命運等多種信息。

XAFS技術提供新的視角研究土壤中元素的化學形態(tài)，揭示受污土壤中微量毒性元素與自然系統(tǒng)的相互作用。Flogeac等[34]用實驗室模擬的方法在石灰性土壤中人為地加入Cu，模擬天然土壤中Cu的吸附機理，并用電子順磁共振(Electron paramagnetic resonance, EPR)和XAFS方法對其進行測定，根據(jù)XANES和EPR譜圖并對EXAFS譜進行擬合獲得Cu第一殼層的配位信息，發(fā)現(xiàn)Cu主要與礦物表面的土壤有機質(Soil organic matter,SOM)結合。Liu等[35]用XAFS分析采自電路板回收廠的Cu污染土壤，他們對XANES譜進行線性擬合，并且對 EXAFS譜進行第一殼層擬合，結果表明土壤中的Cu以Cu-SOM、CuCO3、Cu2O和CuO幾種形態(tài)存在，其中Cu-SOM是主要的存在形態(tài)。

μ-SXRF技術能夠得到土壤中元素的二維分布圖，可用于研究元素間的相關性，為目標元素存在礦相提供參考。Terzano等[36]用μ-SXRF研究受污土壤中的Hg元素，通過μ-SXRF掃描獲得的元素分布圖發(fā)現(xiàn)，Hg與Cl和S顯著相關，但與Fe不存在相關性，說明Hg并不像通常所認為的一樣與含鐵礦物相結合，而更有可能存在于一種含S和Cl的礦物中。Khaokaew等[37]對從鋅礦區(qū)采集的水稻土壤樣品進行μ-SXRF分析，通過微區(qū)X射線熒光結果表明，Cd元素的分布與Ca元素顯著相關，而并非如通常所認為的與 Zn相關，研究結果表明，相對于Zn，Cd與Ca似乎更有可能存在于一個礦相。

更多的情況下，同步輻射XAFS與μ-SXRF聯(lián)合用于研究土壤中元素的分布與形態(tài)。首先對樣品進行微區(qū)X射線熒光面掃描，確定感興趣元素存在區(qū)域，再對該區(qū)域進行微束XRF探測和XAFS形態(tài)分析。例如，Strawn等[38]研究了長期受Cu污染的天然土壤，用μ-SXRF和μ-XAFS對土壤樣品進行詳盡的分析，發(fā)現(xiàn)土壤中的Cu分布并不均勻(圖4)，并且濃度最高的點只有幾個像素寬，說明土壤中Cu高的部分由小富銅顆粒組成；在μ-SXRF元素分布圖中，Cu像素最高的點缺少高計數(shù)的S、Si、K和P的峰，并且缺少顯著的Ca、Fe或者Mn的熒光信號，表明 Cu在土壤中并不是以硅酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽或者粘土礦物的形式存在，也不與 Ca、Fe和Mn的金氧化物或碳酸鹽相連，因此推測土壤中的Cu是以Cu的（氫）氧化物、Cu的碳酸鹽形態(tài)存在，或者是直接吸附到 SOM 上；進一步對樣品上的兩個高點Spot1和Spot2進行Cu的K邊吸收譜分析，并與CuCO3·Cu(OH)2、 Cu(OH)2、Cu2+Ads.Elliot HA(Cu 吸附 Elliot HA)等多種標樣進行比對，用Cu(OH)2和Cu2+Ads.Elliot HA對樣品的譜圖擬合結果最好，其中Cu2+Ads.Elliot HA對擬合曲線有90%的貢獻，推測Cu主要是吸附在Elliot HA上。

上述研究展示了XAFS和μ-SXRF分析技術成功地應用于土壤和沉積物中的元素分布與形態(tài)研究，推進了研究者對土壤和沉積物中元素相互作用、遷移性、毒性等的理解。

2.3 植物中的耐受機制

植物形成了生態(tài)系統(tǒng)的第一營養(yǎng)級，因此要研究元素在生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的行為，就要徹底地了解元素在植物器官內(nèi)的吸收、轉運、耐受機制和積累機制。近年來，隨著μ-SXRF的出現(xiàn)和飛速發(fā)展，使得植物內(nèi)部甚至亞細胞水平的相關金屬的分布研究成為可能。與μ-XAS聯(lián)用，能夠原位研究植物內(nèi)感興趣金屬元素的形態(tài)。

μ-SXRF能夠在細胞或亞細胞水平研究植物中金屬和類金屬的富集部位[39?43]。例如 Fukuda等[1]用光斑尺寸為3.8 μm×1.3 μm的微束X射線在亞細胞水平對Cd超富集植物擬南芥進行μ-SXRF掃描分析，獲得的二維熒光圖像顯示 Cd高度富集在葉片表面的香毛簇。類似地，F(xiàn)reeman等[39]用微束X射線對Se超富集植物紫云英的幼葉進行掃描發(fā)現(xiàn)，Se主要富集在葉片表面的毛狀體上，并且通過 Se的信號可推測，毛狀體部位的Se濃度約比葉片其余部位高 10倍。Kopittke等[41]用配備快速探測器的μ-SXRF 對經(jīng)過 24 h As(Ⅲ)和 As(Ⅴ)浸泡豇豆新鮮根部組織進行探測，圖像顯示 As主要積累在根部的內(nèi)皮和中柱鞘細胞。

XAFS能夠測定植物鮮樣組織中元素的配位環(huán)境和化學形態(tài)。Lombi等[44]用XANES技術研究蕨類植物蜈蚣草(Pteris vittata)中As的形態(tài)，研究發(fā)現(xiàn)植物的葉片中砷主要以As(Ⅲ)的形式存在。這一觀點后來被webb等[45]證實，并結合EXAFS研究，發(fā)現(xiàn)在新鮮葉片中，三價砷主要是以水合亞砷酸離子即非配位的亞砷酸鹽的形態(tài)存在。然而，隨著新鮮葉片的老化干燥，葉片中砷的形態(tài)逐漸由As(Ⅲ)轉化為As(Ⅴ)(圖5)。推測這種亞砷酸鹽可能存貯于植物的液泡中。

用XAFS和μ-SXRF相結合的方法研究植物新鮮樣品中重金屬元素的形態(tài)和分布，能夠推測重金屬元素從土壤轉移到植物的生物化學途徑和機制[46?48]。Pickering 等[46]用 μ-XANES 和 μ-SXRF 對蜈蚣草新鮮組織進行研究，在砷酸鹽和亞砷酸鹽兩種吸收邊能量下分別對蜈蚣草的配子體進行μ-SXRF掃描分析，觀察到亞砷酸鹽主要分布在細胞中央而遠離細胞壁，基于蕨類植物細胞中液泡位于細胞中間并且占據(jù)著大部分的細胞空間，因此再次驗證了蜈蚣草葉片中砷以亞砷酸鹽的形態(tài)分布在液泡中；對蜈蚣草的根、葉軸、葉三部分進行μ-SXRF掃描分析，觀察到砷酸鹽(As(Ⅴ))分布在葉脈中心，而砷的硫化物 As(SR)3則像一個圓柱外殼，緊密地環(huán)繞在葉脈上砷酸鹽的周圍。進一步對蜈蚣草的根、葉軸、葉部分進行XANES分析，發(fā)現(xiàn)植物根中由As(Ⅴ)(90%±4%)和 As(Ⅲ)(10%±5%)組成，植物葉軸中為 24% 的 As(Ⅴ)和 76%的 As(Ⅲ)，植物羽葉中砷的形態(tài)主要為As(Ⅲ)(95%±1%)，并含有微量的硫化物砷官能團(As(SR)3)(5%±1%)，由以上推測砷的硫配體復合物可能是植物提取和傳輸砷的過程中將As(Ⅴ)還原為As(Ⅲ)的重要媒介。

圖5 蜈蚣草葉片在干燥過程中不同階段的K邊XANES譜線，隨著老化過程的進行，葉片中砷的形態(tài)逐漸由As(Ⅲ)轉化為 As(Ⅴ)，樣品中砷的濃度約為 1 000 μg·g?1[45]Fig.5 Arsenic K-edge XANES data of Pteris vittata leaves atvarious stages of drying. The shift in oxidation state from As(Ⅲ) to As(Ⅴ) can be seen as the aging process progresses.Arsenic concentration is approximately 1 000 μg·g?1[45].

XAFS和μ-SXRF相結合的方法能研究植物在受毒性元素脅迫時的存儲、耐受和解毒機制[49?50]。Isaure等[49]對經(jīng)過 Cd浸泡的超富集植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)進行研究，發(fā)現(xiàn)在擬南芥根部Cd位于維管束中，并且與硫配體相結合，而在擬南芥葉片組織中毛狀體是大量的 Cd的存貯部位，并且Cd LIII-edge μ-XANES結果顯示擬南芥葉中Cd主要與來自細胞壁的O/N配體結合(約75%)，少量與S配體結合(約25%)。可見在擬南芥根部和葉片部位Cd的主要存貯方式并不相同。研究結果表明，當 Cd進入生物體后，生物體本身可能有一定調節(jié)能力。Seyfferth等[50]研究人工培養(yǎng)的As污染水稻根部樣品，發(fā)現(xiàn)在水稻根部表面含鐵斑塊可見的部位，As和Fe共同存在，對其中As化合物進行線性擬合，發(fā)現(xiàn)由 66%?87%的 As(Ⅴ)和 0%?15%的As(Ⅲ)組成。由此推測，水稻根部的含鐵斑塊可能為As(Ⅴ)進入植物體提供了一道屏障。以上研究結果與以往研究者發(fā)現(xiàn)的土壤中重金屬被植物根吸收后，沿著植物干部運輸?shù)饺~部過程中植物會對重金屬進行一些去毒化處理[51?52]相符合。

以上研究均顯示XAFS和μ-SXRF已經(jīng)成功應用于植物中的元素分析，不僅突破了常規(guī)方法，能夠在細胞和亞細胞水平測定元素的微區(qū)分布和存在形態(tài)，而且為水合鮮樣提供了更加便捷和可靠的途徑，為揭示植物中毒性元素的行為機制提供了重要線索。

2.4 蚯蚓中的代謝過程

蚯蚓是陸地生態(tài)毒理學中一個非常重要的角色[53]，被稱為“生態(tài)系統(tǒng)工程師”[54]。它不僅能夠通過自身活動改善土壤性質，而且還能對與土壤生態(tài)系統(tǒng)相關的其他生物如植物[55]、微生物[56]產(chǎn)生影響。最重要的是，它能夠在受污染的土壤中定居生存，因此，蚯蚓如何通過自身的吸收與代謝等生命活動使其免受有毒元素的毒害并參與到這些元素在生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的遷移和循環(huán)[57]成為科學家們研究的熱點。同步輻射XAFS和μ-SXRF通過測定蚯蚓體內(nèi)元素的形態(tài)與分布幫助理解其代謝過程和機理[58]，目前已經(jīng)成為研究蚯蚓體內(nèi)元素行為所廣泛采用的手段。

近年來，已經(jīng)有很多研究者利用同步輻射μ-SXRF測定蚯蚓體內(nèi)毒性元素的富集位點。Morgan等[13,59]在最近的研究中，用μ-SXRF對蚯蚓組織鮮樣進行微區(qū)掃描，獲取的元素熒光分布圖表明 Zn、Pb、Ca元素主要分布在排列在后部消化道周圍的 chloragogenous組織。這一結果與 Cotter等[60]的研究類似，該作者用電子探針X射線微區(qū)分析和同步輻射X射線吸收譜分析研究受污染的農(nóng)田中天然蚯蚓，電子探針結果表明蚯蚓的代謝活動有效地將金屬運移到特定的亞細胞分區(qū)位點。通過以上研究，可推測當蚯蚓受到重金屬的脅迫時，傾向于通過體內(nèi)某個部位有效的積累和固定來使毒性得以避免。

用XAFS分析蚯蚓中重金屬元素或毒性元素的配位環(huán)境，并與其它技術手段結合能夠推測蚯蚓體內(nèi)元素的代謝機理[60?62]。例如 Arnold 等[61]用 XAFS對銅礦區(qū)土壤（王水 Cu=(789±4) mg·kg?1）中的蚯蚓和含有 Cu的牲畜棚環(huán)境（王水 Cu=(54±1)mg·kg?1）中的蚯蚓進行研究，有三點重要發(fā)現(xiàn)：一是整體水平的蚯蚓、蚯蚓的后部和蚯蚓的體壁三種樣品之間 Cu的形態(tài)無明顯差別，并且生長于以上兩種環(huán)境下和生長于人工配制土壤中蚯蚓的Cu的形態(tài)也無明顯差異；二是蚯蚓樣品中Cu的配位環(huán)境是 3個 S原子，Cu-S鍵的配位距離為0.22nm，而實驗中幾種土壤中Cu的EXAFS數(shù)據(jù)均顯示Cu與4個O原子相連，Cu-O鍵長為0.19 nm；三是化學分析結果顯示，對采自以上兩個地區(qū)的同類型蚯蚓在完全相同的條件下培養(yǎng)，銅礦區(qū)土壤中生長的蚯蚓能夠富集更多的Cu。

以上研究結果表明，同類型蚯蚓體內(nèi)不同部分的Cu以及不同類型蚯蚓中Cu很有可能以一種形態(tài)存在，唯一不同的是在 Cu濃度高的環(huán)境下成長起來的蚯蚓能夠富集更多的Cu，由此推測，這一地區(qū)的蚯蚓的代謝機理是一種可逆的生理變化而非基因結構改變導致的功能性變化。但這一推測要經(jīng)過對下一代或者第三代蚯蚓進一步研究才能確證。經(jīng)過蚯蚓的代謝活動之后，Cu的形態(tài)明顯發(fā)生了改變，配位形式由Cu-O變成了Cu-S，推測這種S配體有可能來自金屬硫蛋白[60,62]，但由于缺少XANES分析的Cu的標準物質，不能就此確定Cu與金屬硫蛋白復合物配位，需要進一步研究。

以上研究均表明μ-SXRF和XAFS已成功應用于蚯蚓體內(nèi)元素的分布與形態(tài)分析，并且能夠在低溫下對蚯蚓活體或者新鮮組織樣品進行分析，突破了以往技術手段蚯蚓活體分析的難題，推進了蚯蚓體內(nèi)元素代謝過程研究的發(fā)展。

3 結語

大氣、土壤及動植物樣品中重金屬和類金屬等毒性元素的行為研究是目前最引人注目的研究領域之一。自從人們認識到元素形態(tài)比元素含量對生物效應的影響更為重要后，研究者更關注毒性元素的形態(tài)特征及在生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的遷移規(guī)律和在生物體內(nèi)的轉化過程，隨著研究的深入，在細胞及亞細胞水平等微尺度的研究日益迫切。同步輻射微區(qū)分析技術因其獨有的特性為我們提供了微尺度的元素分布、元素形態(tài)、金屬蛋白特征和金屬與生物分子的代謝機理等多重信息。近30年同步輻射技術發(fā)展迅速，光源的進步、探測系統(tǒng)的更新?lián)Q代及多種同步輻射技術的聯(lián)用，使其在動植物體內(nèi)重金屬行為、固-液界面、礦物-水溶液、生物膜與重金屬相互作用、樣品微觀結構等研究領域取得了顯著進展，為揭示元素的遷移轉化規(guī)律及產(chǎn)生的生物效應帶來強大推動力。目前，越來越多的研究者投身這一領域，并作出卓越貢獻。

但是，同步輻射微區(qū)分析技術在大氣、土壤和動植物樣品分析中仍存在很多難題。如光斑尺寸仍相對滯后于高分辨研究發(fā)展的需求、低含量元素的形態(tài)分析和生物樣品中與金屬螯合物密切相關的輕元素（如N、P、S）難以直接測定，植物鮮樣和動物活體等水合樣品的輻射損傷等。因此，進一步提高第三代光源的性能和第四代光源的發(fā)展成為一個必然趨勢，獲得更高亮度的單色光及更小的光斑尺寸；此外，新型能量探測器的改進有望進一步提高能量分辨率和探測器靈敏度?？傊磥硗捷椛湮^(qū)分析技術的發(fā)展將充分發(fā)揮高時間分辨率、高空間分辨率、高能量分辨率和高偏振的特性，相信隨著同步輻射技術的發(fā)展，它將在大氣、土壤和動植物等樣品研究領域呈現(xiàn)出更大優(yōu)勢。

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